| 研究課題/領域番号 |
26440154
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
高瀬 智敬 学習院大学, 理学部, 助教 (30392012)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 光周性 / 花芽形成 / シロイヌナズナ / 環境応答 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、長日条件でfkf1の花成遅延が回復したfkf1サプレッサーをスクリーニングすることで、新規の光周性花成を抑制する因子を単離し、その作用点を明らかにすることで、複雑に制御された光周性花成制御経路に関する新たな知見を得ることである。昨年度は、fkf1サプレッサーの花成時期の測定、fkf1サプレッサーのFT発現量の解析、ポジショナルクローニングによる変異遺伝子の同定、の三つの研究を実施した。
fkf1サプレッサーの花成時期の測定では、スクリーニングで取得したサプレッサーの花成促進が光周期に依存しているか明らかにするために、長日条件でスクリーニングした際に野生型の抽台よりもやや遅い40日頃までに抽台が認められたサプレッサーについて、長日条件、及び短日条件の花成時期を測定した。光周期に関わらず早咲きを示すサプレッサーがある一方で、長日条件で顕著に花成が促進したサプレッサーも見られた。
fkf1サプレッサーのFT発現量の解析では、光周性花成が活性化されたサプレッサーを選抜する為に、長日条件下で40日頃までに抽台するサプレッサーについてFTの発現量を測定した。FTは光周性花成を促進する重要な因子であり、fkf1ではこのFTの発現が一日を通して抑制されているが、殆どのサプレッサーでFTの発現量がfkf1に比べて2倍以上に増加し、野生型と同程度までFTの発現が増加したサプレッサーも見られた。
ポジショナルクローニングによる変異遺伝子の同定では、サプレッサーの変異遺伝子を同定するために、Col系統のサプレッサーとLer系統のfkf1との掛け合わせを行い、得られたF2種子を使用してポジショナルクローニングを行った。これによって変異の原因遺伝子が座乗している領域を絞り込んだ後に、塩基配列を確認することで変異遺伝子を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題について、今年度はまずfkf1サプレッサーの花成時期の測定、及びfkf1サプレッサーのFT発現量の解析を行うことで、光周性花成経路が活性化されたサプレッサーの探索を進めた。そして興味深い形質を示すサプレッサーについて、ポジショナルクローニングによる変異遺伝子の同定を進めた。
長日条件でfkf1よりも花成が促進されたサプレッサーとしておよそ50ラインを取得しているが、スクリーニング時にfkf1よりも明らかに花成が促進された約40ラインについて、花成時期の測定を行った。その結果、長日条件で顕著に花成が促進されるサプレッサーや、光周期に関わらず著しく花成が促進されるサプレッサーのように、興味深い形質を示すサプレッサーが複数見つかった。また、長日条件で野生型と同時期までに花成が認められる25ラインのサプレッサーについて光周性花成を促進する遺伝子であるFTの発現量を調べたところ、fkf1よりも明らかにFTの発現が増加したサプレッサーが複数見つかった。今年度以降に、これらサプレッサーを対象に変異遺伝子の同定や、変異遺伝子の作用点の解明を進めていく予定である。
長日条件で顕著に花成が促進されるなど、興味深い形質を示すサプレッサーを優先して、ポジショナルクローニングとそれに続く塩基配列の解析により変異遺伝子の同定を進めた。これまでに6ラインのサプレッサーについて変異遺伝子を同定している。これら変異遺伝子の中には既知の花成抑制因子が含まれていたが、光受容体フィトクロムの色素団合成に関わる因子やDNAポリメラーゼのサブユニットをコードする遺伝子のように、これまでに花成時期の制御への関与が知られていない遺伝子にも変異が生じていたサプレッサーも見つかった。これらのサプレッサー以外にもポジショナルクローニングを順次進めており、今後もサプレッサーの変異遺伝子の同定を進めていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に続き、ポジショナルクローニングによる変異遺伝子の同定を行い、さらに別アリルを使用したfkf1サプレッサー形質の再現性の確認、単離した早咲き変異遺伝子の作用点の解明を行う。
別アリルを使用したfkf1サプレッサー形質の再現性の確認では、単離した変異遺伝子が花成促進の原因遺伝子なのかを確かめるために、サプレッサーで変異が見つかった遺伝子の遺伝子破壊体をABRC（T-DNA挿入個体）、あるいは理化学研究所バイオリソースセンター（トランスポゾン挿入個体）等から取り寄せる。それらをfkf1と掛け合わせをすることで、別アリルでもサプレッサーの早咲き形質が再現されるか確認する。さらに、このようにして作成した二重変異体とfkf1サプレッサーとを掛け合わせることで、早咲き形質が相補されるか否かを確認する。また、それぞれのサプレッサーに変異のない正常な候補遺伝子を導入した形質転換体の花成時期を測定することで、早咲き形質が相補されるか否かを確認する。
単離した早咲き変異遺伝子の作用点の解明では、単離した変異遺伝子がどのような機構で花成を抑制するのか明らかにする。FTの発現量がfkf1よりも増加したサプレッサーについて、まずFT, CO, CDF1等の光周性花成を制御している因子の一日の遺伝子発現パターンをリアルタイムPCRにより調べる。そしてpFT:GUS等のGUSレポーターを用いることで、それぞれのサプレッサーにおける花成制御遺伝子の空間的な発現パターンを観察することで、単離した変異遺伝子の光周性花成経路上の作用点を明らかにする。さらに、サプレッサーと野生型を掛け合わせることでFKF1が正常なサプレッサーを取得する。それらの花成時期を測定することで、サプレッサーの早咲き形質がfkf1変異に依存しているか否かを明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は、長日条件でスクリーニングされたfkf1サプレッサーの花成時期の測定と、fkf1サプレッサーのFT発現量の解析、ポジショナルクローニングによる変異遺伝子の同定を行った。これらの解析の内、遺伝子発現の解析、及びポジショナルクローニングを進めるためには、核酸を調製するための試薬やPCRを行うための試薬が必要であった。しかし、前年度までに購入していたこれらの試薬がまだ残っていたため、今年度はそれらを使用して解析を行った。これら以外の本研究に使用した試薬、消耗品についても、同様に前年度までに購入されていた試薬を用いた。また、今年度は日本分子生物学会年会、及び日本植物生理学会年会に参加したが、どちらも大学から近かったために、計上した旅費を使用しなかった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度は前年度に引き続きポジショナルクローニングによる変異遺伝子の同定を進め、さらにそれぞれのサプレッサーにおける花成制御遺伝子の発現解析を計画している。これらの解析を行うために、核酸を調製するための調製やPCRを行うための試薬の購入を予定している。また、GUSレポーターを用いて花成制御遺伝子の空間的な発現パターンの解析を計画しており、これに使う試薬についても購入を予定している。さらに、これら以外に本研究で使用する制限酵素などの分子生物学試薬やプラスチックシャーレなどの消耗品についても必要時に購入する。また今年度の日本分子生物学会年会は神戸で、日本植物生理学会年会は岩手で行われるため、これらに参加するために旅費を使用する予定である。
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