研究課題
高等植物のペルオキシソームは、脂肪酸代謝や光呼吸、活性酸素種の除去、オーキシンやジャスモン酸の生成など、植物の一生を通して様々な機能を担う重要なオルガネラである。これらのペルオキシソーム機能が低下すると、種子の発芽不全や個体の成長抑制、配偶体の認識異常など正常な生育に影響を及ぼす。ペルオキシソームを構成するタンパク質は全て核遺伝子にコードされており、ペルオキシソームが担う様々な機能の獲得には、遺伝子発現、ペルオキシソームへのタンパク質輸送、タンパク質の活性発現、タンパク質分解といった各段階での調節が重要であるものの、その分子機構は十分に理解されていない。本研究では、申請者が単離したシロイヌナズナの apem (aberrant peroxisome morphology) 変異体を主な材料として、ペルオキシソームタンパク質輸送に関わる因子の同定と、それら因子におけるネットワークを明らかにし、植物の高次機能を支えるペルオキシソーム機能発現を分子レベルで理解することを目指す。
2: おおむね順調に進展している
apem変異による植物個体への影響の解析と電子顕微鏡による細胞内の超微細構造解析、および APEM 因子の局在解析は順調に進めることができた。特に、ペルオキシソームタンパク質レセプターのペルオキシソームからサイトソルへのリサイクルに関与する PEX4 の局在を、免疫電子顕微鏡観察で同定することに成功した。この PEX4 はユビキチン系の E2 酵素として機能することを明らかにしているため、その変異体である apem7 がユビキチン系のどのステップに異常を示すのかを、in vitro ubiquitin系による解析を進めている。今後の解析から、ユビキチン系に依存したタンパク質輸送の分子機構の一端が明らかにできると期待される。PEX4 を含め、ペルオキシソームタンパク質輸送に関わる因子を複数単離することに成功している。その相互作用について、Bimolecular complementation (BiFC) 法により明らかにする予定であったが、機器の不具合で当初より少し遅れ気味である。BiFC 用のコンストラクトの作製は終了し、機器のメンテナンスも終わり実験を再開したので、本年度中に因子群の相互作用についてデータを取得していく予定である。
In vitro ubiquitin 系と Bimolecular complementation 法による相互作用実験は、引き続いて解析を行い、ペルオキシソームタンパク質輸送におけるユビキチン系の関与と、これまでに同定した因子の相互作用の分子機構を明らかにする。また、平成 26 年度より、ゼニゴケを用いた系を開始した。これは、本申請に関わる因子が全てゼニゴケゲノムに存在することを確認できたため、一倍体の生活環が長いゼニゴケを用いることで、研究を迅速に進めることができると同時に、ペルオキシソームタンパク質輸送機構の普遍性についても迫れると考えたからである。既に、ゼニゴケにおけるペルオキシソームの可視化は終了し、現在、PEX4 をはじめとするペルオキシソームタンパク質輸送の関連因子のノックダウンおよびノックアウト株を作製中である。このゼニゴケを用いた研究は、京都大学の河内博士と西浜博士、近畿大学の大和博士と共同で進めていく体制となっている。
平成 26 年度に行った実験のうち、ペルオキシソームタンパク質輸送関連因子の相互作用を Bimolecular complementation 法で解析予定であったが、機器の不調により当初予定していた実験回数をこなすことができなかった。そのため、実験に使用する金粒子や高濃度のプラスミドを生成するキット、蛍光観察するためのスライドグラスなどの消耗品の購入が予定に比べ少なかった。機器については既に復旧しているので、平成 27 年度に実験を行う予定である。
タンパク質輸送因子である APEM2/PEX13、APEM4/PEX12、APEM7/PEX4、APEM9、PEX1、PEX6、PEX14 の相互作用を、Bimolecular complementation 法により明らかにする。加えて、これまでに解析してきたシロイヌナズナのペルオキシソーム輸送変異体 apem2、apem4、apem7、apem9 に加え、新たに作製した多重変異体 apem2apem7、apem4apem7、apem7pex22、apem2 apem4apem7におけるペルオキシソームへのタンパク質輸送と、ショ糖要求性と光呼吸活性などペルオキシソーム機能を解析する。このための研究支援員の雇用費と必要な試薬、および研究成果を発表するための学会参加に充当する。
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すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 4件、 オープンアクセス 3件、 謝辞記載あり 4件) 学会発表 (3件) 図書 (1件)
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