| 研究課題/領域番号 |
26440164
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
内山 実 富山大学, 大学院理工学研究部(理学), 客員教授 (50095072)
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| 研究分担者 |
今野 紀文 富山大学, 大学院理工学研究部(理学), 助教 (50507051)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 無尾両生類 / 体液恒常性 / 吸水行動 / アンギオテンシンII / 脳室周囲器官 / c-fosタンパク |
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| 研究実績の概要 |
陸生動物にとって「渇き」を感じることは，飲水を誘発して体液恒常性を維持するために最も本質的な生理現象の一つである． 両生類がどのような生理機構によって渇きを感じ，水場を探して(索水行動)，皮膚から吸水している(経皮性吸水行動)のかを個体・器官ならびに細胞・分子レベルにおいて解析を行った．
（１）索水行動と吸水行動の観察. 多様な環境に適応している無尾両生類の環境選択性について行動観察を行った．乾燥処理後に索水と吸水は促進されるが，長期絶水により索水行動は陸生種と樹上生種で不活発になり，夜間行動も低下した．一方，半水生種では絶水処理により行動が活発化した．吸水については，低張液環境への滞在時間が半水生種では最も長く，陸生種，汽水生種と樹上生種は陸での滞在が長かった．オオヒキガエルにおいて，環境水中へのAmiloride処理による影響は見られなかった．無尾両生類では索水・吸水行動の違いが，生息環境への適応に役立っていることが示唆された．末梢受容体は環境水中のNa+濃度で無く，溶液浸透圧を受容していると考えられる．
（２）乾燥処理により活性化する中枢神経系領域の探索. アマガエルとオオヒキガエルの脳連続切片を作成した．また，中枢神経系の血液脳関門領域を同定した．アマガエルc-fosタンパクをクローニングし，特異抗体を作成した．ウシガエルのアンギオテンシン1型受容体（ATR1)とアンギオテンシン２型受容体（ATR2)をクローニングし，各抗体を作成した．c-fosタンパク発現部位については，解析が進んでいる．今後はアンギオテンシン各受容体の発現部位の同定とc-fosタンパクとの共局在部位を明らかにしていく．
（３）脳室内投与と脳領域破壊実験. アマガエルとウシガエルの脳室内ホルモン投与実験を行った．アマガエルの脳弓下器官の同定と破壊実験を試みている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
（１）索水行動と吸水行動の観察. 多様な生態系に生息する無尾両生類各種について，索水・吸水行動を昼夜にわたりビデオ記録した．これらの解析結果は，両生類各種の生活パターンから予想されうる行動を示したことから，両生類が各生息環境へ適応するためには索水と吸水行動様式が重要であることが明らかになった．
（２）各種抗体による免疫化学実験．これまで市販のc-fos抗体を使用してきたが，実験技術を必要とする浮遊法に不慣れなためもあり，両生類脳における陽性反応部位の特定において安定した結果が得られず実用性に欠いた．このため，年度途中において新たに両生類用の抗体を作成した．したがって，二重免疫実験については次年度以降におこなう．
（３）ホルモンならびに拮抗剤の脳室内投与ならびに脳領域破壊実験．アマガエルならびにウシガエルの脳室および背側リンパ嚢へのAngⅡ投与は，対照群のカエルに比較して，吸水時間を有意に延長した．AngⅡ1型受容体拮抗剤はAngⅡによる作用を有意に抑制した．これにより両種ともに脳室近傍にAngⅡを受容する部位が存在することは明らかである．脳領域破壊実験は予備実験を重ねている．
実験手技を持ったマンパワーの確保が難しいこともあって，計画はやや遅れている．
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究を踏まえての今後の研究方針.
（１）索水行動と吸水行動の観察．行動解析実験は平成26年度において，ほぼ完了した．赤外線カメラを用いて夜間行動を解析する実験を補完する．
（２）AT1RとAT2Rの脳領域における分布ならびに二重免疫法による研究. 昨年度作成したAngⅡ各受容体抗体を用いて，脳領域のc-fosタンパク発現部位との共発現部位を明らかにする．
（３）AngⅡとAngⅡ1型受容体拮抗剤の脳室内投与実験ならびに脳破壊実験. 大型種を用いて脳領域の破壊による実験を継続する．
（４）浸透圧受容器としてのTRPV1とTRPV4ならびにNaxに関する研究．哺乳類が絶水時に感じる「渇き」感覚は脳室周囲器官が重要であり，最近の研究から中枢の[Na+]濃度センサーとして，Naxの重要性が注目されている．無尾両生類においても同様に絶水状態になると脱水が生じ，体液浸透圧が上昇し，「渇き」感覚が生じていることは明らかである．無尾両生類が哺乳類と異なる点は，体表からの水分の蒸泄が盛んで体液濃縮が生じるが，水分の過剰喪失を抑制するために血中尿素濃度が上昇することにある．一方で，血中Na+濃度は比較的安定している．我々のグループによる研究から，アマガエルではTRPV4が浸透圧受容に働く可能性が示された．現時点で，TRPV関連とNaxと同時並行的に研究を進めることを変更して，先ずTRPVについて研究を進める．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
受注した抗体作成が予定より遅れ，支払が次年度にずれ込んだため．
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| 次年度使用額の使用計画 |
受注した抗体の支払いに充てる．
平成27年度以降の生理実験を進めるために,人件費と謝金に使用する．
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