| 研究課題/領域番号 |
26440166
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| 研究機関 | 浜松医科大学 |
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研究代表者 |
堀口 涼 浜松医科大学, 実験実習機器センター, 技術職員 (70452969)
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| 研究分担者 |
足立 直樹 浜松医科大学, 実験実習機器センター, 技術職員 (70300853)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 生殖細胞 / 性決定 / 性転換 / 性的可塑性 / ミツボシキュウセン / フローサイトメトリー / 卵巣 / 精巣 |
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| 研究実績の概要 |
魚類には、一度、性成熟した後に性を変えることのできる性転換魚が存在する。これまでの研究で、雌から雄に性転換するミツボシキュウセンの卵巣に精巣組織は存在しないが、性転換により生ずる精子の起源は卵巣内に存在する生殖原細胞である可能性を示してきた。しかし、この生殖原細胞が卵原細胞なのか、それとも雄化が可能な別の細胞群なのかは不明なままである。本研究では、性転換前後の生殖原細胞についてトランスクリプトーム解析を行い、これまで未解明であった生殖細胞の性的可塑性や性差を生み出す分子機構を解明することを目的としている。
今年度は、卵巣や精巣、さらに性転換誘導後の生殖腺からの生殖原細胞の単離法を確立し、これらの細胞で発現している遺伝子を次世代シークエンサーを用いて網羅的に解析することを計画していた。
はじめにミツボシキュウセンの卵巣や精巣の細胞を酵素的に分散し、BSAの密度勾配遠心法による分離を試みたが、生殖原細胞だけを分離することはできなかった。
次に、フローサイトメーターを用い、直方散乱、側方散乱の違いによる分離法、さらにHoechst染色によるside population(SP)の分離法を試みたが、これらの方法だけでは生殖原細胞を分離できなかった。
しかしながらフローサイトメーターは細胞をその種類ごとに分離し、特に分散が不十分な細胞を除去するには非常に有効であると考え、生殖細胞にGFPを特異的に発現するメダカを用い、細胞の分離条件のさらなる検討を行った。その結果、GFPとSP活性を指標に生殖原細胞を含む細胞群の分離に成功した。さらにGFPを発現しない系統においても、幹細胞マーカーを指標にした分離法を用いることで、生殖原細胞を分離できることをみいだした。今後、この方法を用いてミツボシキュウセンの生殖原細胞の分離法の確立をめざす。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は、ミツボシキュウセンの生殖原細胞の単離法を確立し、生殖原細胞のRNA-seq解析を行うことを計画していた。しかしながら、現時点でその計画は達成できていない。
本研究の目的としている生殖原細胞の遺伝子発現解析には、当初予定していたBSA密度勾配遠心法は適していないことがわかった。そこでフローサイトメーターを活用した分離法の検討を続けてきた。その条件検討の過程で、まず、生殖細胞にGFPを特異的に発現するメダカを用い、GFPとSP活性を指標にした精原細胞の単離に成功した。さらに幹細胞マーカーとSP活性を組み合わせた精原細胞の分離法を確立した。この方法はGFPを持たないメダカ系統において確認され、すなわち遺伝子組換え法が確立していないミツボシキュウセンにおいても有効な手法であると期待される。
早急に、この手法がメダカ卵巣やミツボシキュウセン生殖腺でも生殖原細胞の分離に適応できるかどうか確認し、次のステップである遺伝子解析を進めていきたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究の今後の推進方策として、まず、フローサイトメーターを用いた生殖原細胞の分離法を引き続き検討していく。上述のメダカ精巣を用いて新たに見いだした幹細胞マーカーとSP活性を組み合わせた分離法が有効かどうか、メダカ卵巣、ミツボシキュウセン生殖腺（精巣、卵巣、性転換生殖腺）を用いて検討する。
また、RNA-seqに用いるライブラリー作成の条件検討を平行して進めていく。すでに分離に成功しているメダカ精原細胞をモデルとし、用いる細胞の個数や増幅の度合いなど様々な条件の検討、信頼性の高いライブラリー作成をめざす。また、シークエンス条件の検討、シークエンス後のデータ解析に関しても、ゲノム解析が進んでいるメダカをモデルに、一連のRNA-seq解析の手法を確立し、ミツボシキュウセンにおける解析にむけて準備しておく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度請求した物品費のうち、約100万円を次世代シークエンサーによる遺伝子解析用費用として計上していた。しかし、前述のように研究の遅れがあり、遺伝子解析用サンプルが準備できなかったため、遺伝子解析用費用の多くを次年度使用額として繰り越すことになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
今年度の研究により、少なくとも精原細胞の単離法が整いつつあり、まずはこれを遺伝子解析用のサンプルとして解析を進めていく。従って、研究の遅れはあるものの、次年度使用額は従来の予定通り、次世代シークエンサーによる遺伝子解析費用として用いる。
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