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2014 年度 実施状況報告書

両生類における血球産生調節の環境応答に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号 26440171
研究機関早稲田大学

研究代表者

加藤 尚志  早稲田大学, 教育・総合科学学術院, 教授 (80350388)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードエリスロポエチン / トロンボポエチン / アフリカツメガエル / ネッタイツメガエル / 造血 / 赤血球 / 栓球 / 環境
研究実績の概要

本研究は,脊椎動物における調節系の多様性と普遍性を理解する一端として,両生類アフリカツメガエル及びネッタイツメガエルの末梢赤血球数及び末梢栓球数の調節の仕組み,特に低酸素あるいは低温による環境ストレスに応答して変動する血球産生の調節に焦点を当てて取り組む。第1年度では,低酸素in vivoモデルの作出,低酸素化マーカーの探索,低温暴露モデルとの比較,組換えEPO/TPO免疫開始を予定し展開した。
アフリカツメガエル成体を低酸素環境に曝露するために,窒素曝気によって飼育水の溶存酸素濃度を2.2 mg/Lに下げ、ツメガエルを虫かごに補足し30分浸水後,自由に5分間肺呼吸させた。これを6サイクル繰り返す反復潜水モデルを確立した。潜水個体の肺と肝臓の95%以上の細胞は低酸素マーカーのピモニダゾール陽性で低酸素化を認め,肺水腫様の肺障害も認めた。またマロンジアルデヒドを測定する脂質過酸化測定法による酸化ストレスを検出した。従って肺で高発現するEPOの組織障害修復活性を調べる有用なモデルが確立した。
低温暴露モデルにおいては,特に低温曝露後の末梢栓球数減少に注目し,抗栓球抗体(T12)陽性の末梢栓球数数変化をフローサイトメトリーで計測し,また体外で蛍光標識した栓球の再輸血後の臓器分布を追跡した。その結果,低温曝露2時間後から6時間後に末梢栓球数は最低値に達し,その後も低低値を維持した。栓球の一部は脾臓に移行した。このように低温曝露モデルでも,造血制御と連鎖する環境応答を確認することができた。
尚,組換えアフリカツメガエルEPOおよびTPOのモノクローナル抗体作出のため,完全なEPOとTPOの活性体をより高効率的に調製し,安定した長期保存の方法の確立を目指すことにした。今年度はxlEPO,xlTPOのそれぞれについてマルトース結合蛋白質融合組換え体の大腸菌発現系の構築を着手した。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

第1年度の実施予定項目は,低酸素曝露in vivoツメガエルモデル,低温曝露in vivoツメガエルモデルを作出し,赤血球数増減や造血因子発現を調べることや,マウスに組換えEPO/TPOの免疫を開始し,モノクローナル抗体の作出に着手することである。これらのうち,最も高度な実施課題であった低酸素曝露in vivoモデル,低温曝露in vivoモデルの両方とも基礎展開を終了し,学会においても成果発表することができた。従って第2年度移行の分子解析へ進めるための目処がついたといえる。一方,EPO,TPOのモノクローナル抗体作出の着手については,免疫抗原となる遺伝子組換え体の調製方法について,再検討することにした。このため,免疫開始は遅れるが,もとより造血因子の質の確保は長期的視野で重要な課題であり不可避である。それを補完するために,EPOについてはポリクローナル抗体の特性の見直しを再度進めた。その結果,EPO定量系については培養上清等の試料であれば定量測定可能なELISAを試験的に開発した(血液試料については尚も検討を要する)。また,電気泳動後のウエスタンブロット法によるEPOやTPO分子の酵素免疫的検出に際しては,ポリクローナル抗体を利用する。一方,EPO受容体を認識するモノクローナル抗体の作出と抗体性状の確認はほぼ順調である。

今後の研究の推進方策

第2年度では,組換えEPOとTPOのマウス免疫あるいは並行して,EPOやTPOの高純度高活性組換え体が得られれば,ポリクローナル抗体の作出を開始する。ハイブリドーマを半固形培地中で高速選別して単クローン化し(実施経験有り),高性能の抗体を選別する。EPOやTPOの定量系は,各々モノクローナル抗体を2種使う常法によってELISAを構築する。目標測定感度は,数pg/mlである。大腸菌発現組換え体の分子吸光係数(計算値)で校正した標品を標準試料とする。
「リガンド受容体結合調節モデル」を証明する鍵データとなるリガンド-受容体の活性定量解析は,フローサイトメトリ法で分離した受容体発現血球前駆細胞や受容体を発現する末梢血球と,組換えEPO/TPOとを生理的条件下で混合する。その上清に残るEPO/TPOをELISAまたはバイオアッセイで測定し,これらの細胞にEPOやTPOが吸着することを検証する。
オミクス解析に関しては,第1年度で確立した低酸素曝露モデル,低温曝露モデルに関して,肝臓,脾臓,腎臓,骨髄などを取出し,プロテオミクス解析へ進める。同定蛋白質リストをin silicoパスウエイ解析(Pathway Studio)に進め,環境刺激と連動するパスウエイを抽出し,血球調節に至る分子機序の探索を試みる。
第3年度では,特にオミクスから得た知見と,実計測から獲得したデータの整合性を追求し,本研究の総括へ向かう。

  • 研究成果

    (26件)

すべて 2015 2014 その他

すべて 雑誌論文 (6件) (うち査読あり 5件、 オープンアクセス 2件、 謝辞記載あり 2件) 学会発表 (19件) (うち招待講演 2件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] The influence of artificially introduced N-glycosylation sites on the in vitro activity of Xenopus laevis erythropoietin.2015

    • 著者名/発表者名
      Kazumichi Nagasawa, Mizue Meguro, Kei Sato, Yuta Tanizaki, Nami Nogawa-Kosaka, Takashi Kato
    • 雑誌名

      PLoS One

      巻: - ページ: -

    • DOI

      -

    • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] Cellular characterization of thrombocytes in Xenopus laevis with specific monoclonal antibodies.2015

    • 著者名/発表者名
      Yuta Tanizaki, Takako Ishida-Iwata, Miyako Obuchi-Shimoji, Takashi Kato
    • 雑誌名

      Exp Hematol.

      巻: 43 ページ: 125-136

    • DOI

      10.1016/j.exphem.2014.10.005

    • 査読あり / 謝辞記載あり
  • [雑誌論文] トロンボポエチンとトロンボポエチン受容体の構造と作用2015

    • 著者名/発表者名
      黒木良太,宮崎洋,加藤尚志
    • 雑誌名

      血液フロンティア

      巻: 25 ページ: 171-180

    • DOI

      -

  • [雑誌論文] プロテオーム解析による比較生物学的ミッシングリンク探索の実際2014

    • 著者名/発表者名
      永澤和道,渡会敦子,谷合正,竹島功将,加藤尚志
    • 雑誌名

      比較内分泌学

      巻: 40 ページ: 134-139

    • DOI

      -

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] 生物の進化と赤血球造血2014

    • 著者名/発表者名
      加藤尚志
    • 雑誌名

      臨床血液

      巻: 55 ページ: 1777-1784

    • DOI

      http://dx.doi.org/10.11406/rinketsu.55.1777

    • 査読あり
  • [雑誌論文] 赤血球産生と鉄恒常性における環境応答系の探索2014

    • 著者名/発表者名
      加藤尚志
    • 雑誌名

      臨床血液

      巻: 55 ページ: 735-742

    • DOI

      http://dx.doi.org/10.11406/rinketsu.55.735

    • 査読あり
  • [学会発表] アフリカツメガエル組換えトロンボポエチンのジスルフィド結合の決定2015

    • 著者名/発表者名
      髙野仁志,佐藤圭,谷崎祐太,大谷崇仁,谷合正光,竹島功将,加藤尚志
    • 学会等名
      第67回日本動物学会関東支部大会
    • 発表場所
      早稲田大学,東京
    • 年月日
      2015-03-14
  • [学会発表] アフリカツメガエル成体赤血球造血における雌雄差の基礎的解析2015

    • 著者名/発表者名
      岩崎英里子,細沢咲湖,佐藤圭,酒井智文,小坂菜美,加藤尚志
    • 学会等名
      第67回日本動物学会関東支部大会
    • 発表場所
      早稲田大学,東京
    • 年月日
      2015-03-14
  • [学会発表] ネッタイツメガエルトロンボポエチンの動物細胞発現と生物活性の基礎的検討2015

    • 著者名/発表者名
      境俊二,望月瑤子,高野仁志,谷崎祐太,加藤尚志
    • 学会等名
      第67回日本動物学会関東支部大会
    • 発表場所
      早稲田大学,東京
    • 年月日
      2015-03-14
  • [学会発表] アフリカツメガエルエリスロポエチンの酵素免疫学的測定法の構築2015

    • 著者名/発表者名
      佐藤圭,細沢咲湖,永澤和道,谷崎祐太,加藤尚志
    • 学会等名
      第67回日本動物学会関東支部大会
    • 発表場所
      早稲田大学,東京
    • 年月日
      2015-03-14
  • [学会発表] アフリカツメガエルエリスロポエチン受容体を認識するモノクローナル抗体による血球細胞のフローサイトメトリー解析2015

    • 著者名/発表者名
      平田昭人,米塚友香,武藤洋史,藤山真吾,永澤和道,谷崎祐太,加藤尚志
    • 学会等名
      第67回日本動物学会関東支部大会
    • 発表場所
      早稲田大学,東京
    • 年月日
      2015-03-14
  • [学会発表] Environmental responses of hematopoiesis in Xenopus laevis2014

    • 著者名/発表者名
      Takashi Kato, Kazumichi Nagasawa, Takahito Okui, Yuta Tanizaki, Shun Maekawa
    • 学会等名
      The 8th International Symposium on Amphibian and Reptilian Endocrinology and Neurobiology
    • 発表場所
      国立基礎生物学研究所,岡崎
    • 年月日
      2014-11-08
    • 招待講演
  • [学会発表] 生物の進化と赤血球造血(教育講演59)2014

    • 著者名/発表者名
      加藤尚志
    • 学会等名
      第76回日本血液学会学術集会
    • 発表場所
      大阪国際会議場,大阪
    • 年月日
      2014-11-02
    • 招待講演
  • [学会発表] The effects of erythrocyte-derivediron on erythropoiesis inXenopus exposed to low temperature.2014

    • 著者名/発表者名
      Masamitsu Taniai, Kei Sato, Shingo Fujiyama, Takashi Kato
    • 学会等名
      第76回日本血液学会学術集会
    • 発表場所
      大阪国際会議場,大阪
    • 年月日
      2014-11-01
  • [学会発表] Evolutionary conservation of biological activity of Xenopus erythropoietin.2014

    • 著者名/発表者名
      Kei Sato, Tatsuya Irie, Masamitsu Taniai, Takashi Kato
    • 学会等名
      第76回日本血液学会学術集会
    • 発表場所
      大阪国際会議場,大阪
    • 年月日
      2014-11-01
  • [学会発表] A cell transplantation model of TPO-derived hepatic hematopoietic progenitors in frogs.2014

    • 著者名/発表者名
      Yuta Tanizaki, Takato Otani, Yoko Mochizuki, Takashi Kato
    • 学会等名
      第76回日本血液学会学術集会
    • 発表場所
      大阪国際会議場,大阪
    • 年月日
      2014-11-01
  • [学会発表] The structure and biological activity of G-CSF in African clawed frogs.2014

    • 著者名/発表者名
      Gakuto Honda, Takato Otani, Ryo Kuriki, Nobuhiro Onda, Hidekazu Onodera, Tomohiro Kato, Yuta Tanizaki, Takashi Kato
    • 学会等名
      第76回日本血液学会学術集会
    • 発表場所
      大阪国際会議場,大阪
    • 年月日
      2014-11-01
  • [学会発表] 低温曝露後のアフリカツメガエル末梢栓球数減少の経時変化と臓器移行2014

    • 著者名/発表者名
      村瀬絢香,谷崎祐太,柏瀬奈央,望月瑶子,大谷崇仁,加藤尚志
    • 学会等名
      日本動物学会第85回大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] ツメガエル肝臓部分切除個体における赤血球前駆細胞の分布2014

    • 著者名/発表者名
      谷崎祐太,大谷崇仁,望月瑤子,佐藤圭,加藤尚志
    • 学会等名
      日本動物学会第85回大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] 動物細胞で発現した組換えツメガエルトロンボポエチンの分子性状と生物活性2014

    • 著者名/発表者名
      高野仁志,佐藤圭,谷崎祐太,望月瑶子,大谷崇仁,清瀬大貴,加藤尚志
    • 学会等名
      日本動物学会第85回大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] 変態期におけるツメガエル肝臓の赤血球前駆細胞数の推移2014

    • 著者名/発表者名
      細沢咲湖,奥井武仁,小濱聖佳,佐藤圭,加藤尚志
    • 学会等名
      日本動物学会第85回大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] リポ多糖を投与したアフリカツメガエル末梢血球のフローサイトメトリー解析2014

    • 著者名/発表者名
      八木美波,永井豊,木下紗也香,谷崎祐太,加藤尚志
    • 学会等名
      日本動物学会第85回大会
    • 発表場所
      東北大学,仙台
    • 年月日
      2014-09-11
  • [学会発表] Properties of c-Mpl expression in thrombopoietin-derived hepatic hematopoietic progenitors of Xenopus laevis2014

    • 著者名/発表者名
      Yoko Mochizuki, Yuta Tanizaki, Takato Otani, Kei Sato, Megumi Ichisugi, Ayaka Murase, Shunji Sakai, Takashi Kato
    • 学会等名
      43rd Annual Scientific Meeting of ISEH-Society for Hematology and Stem Cells
    • 発表場所
      Montréal, Canada
    • 年月日
      2014-08-22
  • [学会発表] Characterization of immature multipotent progenitors by cell transplantation in frog model2014

    • 著者名/発表者名
      Yuta Tanizaki, Yoko Mochizuki, Takato Otani, Takashi Kato
    • 学会等名
      43rd Annual Scientific Meeting of ISEH-Society for Hematology and Stem Cells
    • 発表場所
      Montréal, Canada
    • 年月日
      2014-08-22
  • [学会発表] Thrombopoietin-induced differentiation and maturation of splenic and hepatic thrombocytes in Xenopus laevis2014

    • 著者名/発表者名
      Takato Otani, Yuta Tanizaki, Yoko Mochizuki, Ayaka Murase, Shunji Sakai, Takashi Kato
    • 学会等名
      43rd Annual Scientific Meeting of ISEH-Society for Hematology and Stem Cells
    • 発表場所
      Montréal, Canada
    • 年月日
      2014-08-22
  • [備考] 早稲田大学分子生理学研究室(加藤尚志)

    • URL

      http://www.f.waseda.jp/tkato/index.html

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公開日: 2016-05-27  

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