| 研究課題/領域番号 |
26440174
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立循環器病研究センター |
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研究代表者 |
海谷 啓之 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (40300975)
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| 研究分担者 |
宮里 幹也 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (50291183)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | グレリン / グレリン受容体 / アホロートル / イベリアトゲイモリ / チョウザメ / 遺伝子発現 / 発生 / 定量的PCR |
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| 研究実績の概要 |
グレリンは、成長ホルモン分泌や摂食、エネルギー代謝などを調節するホルモンである。本研究は、水棲動物が陸に進出する過程のモデルとなる動物に注目し、グレリンやその受容体の存在意義について考察する。平成２７年度は、（１）アホロートル（メキシコサラマンダー）のグレリン受容体の発現調節、（２）イベリアトゲイモリのグレリンの探索、（３）チョウザメにおけるグレリン遺伝子発現調節、について進展があった。
（１）獲得している２種類の受容体のフラグメントを仮にGHS-R1、GHS-R2と呼ぶ。それぞれに特異的なプライマーを作製し、3’および 5’-RACE PCRにて全長cDNAの獲得を試みた。3’側の塩基配列は決定できたが、5’ 側は完全長が得られていない。3’-RACE PCRで得た塩基配列をもとに、定量的PCRを確立し、GHS-R1、GHS-R2の組織分布を調べた。その結果、GHS-R1 mRNAは脳に最も多く、次いで脂肪、腎臓、精巣、胃腸管で高い発現が見られた。GHS-R2の遺伝子発現量GHS-R1の1/10程度で、脳と下垂体に限局していた。
（２）鳥取大から供与していただいたイベリアトゲイモリの２個体分の胃抽出物からグレリンの単離することを試みたが、構造決定には至らなかった。胃のtotal RNAからPCRでのクローニングを試みた。既知の両生類グレリンの塩基配列を元にして作製したプライマーを用いてPCRを行ったが、期待されたPCR産物は得ることができなかった。
（３）チョウザメ（ベステル：Huso huso×Acipenser ruthenus交雑種）の発生過程におけるグレリン遺伝子発現を定量的PCRにて調べた。受精卵では弱いながら遺伝子発現が認められ、受精後６日までに８～240コピー/100ng total RNAまで遺伝子発現が上昇し、孵化後１０日には670～950コピー/100ng total RNA、２０日には4300コピー/100ng total RNAまで急激に遺伝子発現が上昇した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
全体計画の中で、平成２７年度までの達成度は約５０％である。それぞれについては以下の通り。
（１）下垂体でグレリンが作用する機序の解明（達成度５０％）：昨年度、ツメガエルにおいてグレリン受容体に似た２種類の受容体をクローニング後、機能を解析し、それらのオーソログをウシガエルやアマガエルから同定する予定であったが、ツメガエルでその２種の受容体の全長cDNAを得る過程の5’RACE –PCRで期待される産物が未だに得られていない。（２）イモリにおける摂食調節（達成度２０％）：合成イモリグレリンを投与して実験を行ったが、実験中、餌を食べなくなる問題が起こった。個体隔離の影響がありそうだが、検討中に冬場になり摂餌量が落ちた。（３）アホロートルGHS-R1a cDNAのクローニング（達成度５０％）：アホロートルでは２種類の断片が同定できている。RACE-PCRで増幅を試みているが全長は得られていない。（４）肺魚GHS-R1a cDNAのクローニング（達成度１００％）：終了し、論文として公表済み（Gen Comp Endocrinol., 209: 106-117 (2014)）。（５）チョウザメグレリンの単離とcDNAクローニング（達成度９０％）：ベステルの胃からグレリンと、そのcDNAのクローニングに成功している。今年度、組織分布や初期発生過程におけるグレリンmRNAの発現を調べた。（６）アホロートルと肺魚のグレリンの単離とcDNAクローニング（達成度２０％）：胃の組織は収集中である。cDNAクローニングは、胃のcDNAを用いて既知のグレリンの塩基配列からさまざまなプライマーをデザインしてPCRを行ったが、期待される産物が得られていない。（７）チョウザメグレリン受容体のcDNAクローニングと機能解析（達成度１０％）：保有している胃のcDNAを用いてPCRを行ったが目的物の増幅が見られていない。遺伝子発現量が少ない可能性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）下垂体でグレリンが作用する機序の解明：ツメガエルにあるグレリン受容体に類似した２種類の受容体をツメガエルでクローニングしなければならない。下垂体サンプルを含め、サンプルを新たに調整し、受容体の組織分布を調べ、遺伝子発現量の多い組織を選定するとともに、テンプレートcDNAの再調整、RACE-PCRの条件設定の見直しを行う。得られた情報から、それらのオーソログをウシガエルやアマガエルから同定する。（２）イモリにおけるグレリンの摂食調節：摂餌量を測定できる実験条件を設定する。個体隔離の影響を考慮し、数匹をグループとしてイモリグレリン投与実験を行う。（３）アホロートルGHS-R1a cDNAのクローニング：定量的PCRで組織分布と遺伝子発現量を特定した。cDNA単離に有効な組織を用いて全長cDNAの単離を目指す。（４）肺魚GHS-R1a cDNAのクローニング：完了（５）チョウザメグレリンの単離とcDNAクローニング：グレリン遺伝子を単離して塩基配列と遺伝子構造を決める。（６）アホロートルと肺魚のグレリンの単離とcDNAクローニング：胃（腸）のcDNAを用いて、再度cDNAクローニングを試みる。胃からペプチドを単離するため、１０gの胃（１匹約0.5g）を目標に収集している。（７）チョウザメグレリンとGHS-R1a cDNAクローニングと機能解析：脳や下垂体のサンプルを入手し着手する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
27年度は計画していた動物の購入を行わなかった分、研究費が残ることとなった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
最終年度となる28年度に計画している動物購入および組織採集を遂行するので、この研究費はその実行に充てる。
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