研究課題
ミトコンドリアは細胞内で融合と分裂を繰り返している。ショウジョウバエ雄の減数分裂期およびその前後の時期ではとくにミトコンドリア構造およびその分布がダイナミックに変化する。哺乳類の培養細胞では細胞分裂期直前にミトコンドリアが断片化することが知られている。ショウジョウバエの雄減数分裂細胞内のミトコンドリアを免疫染色法で染色し、超解像度顕微鏡を用いて観察しところ、精原細胞の有糸分裂時には、培養細胞と同様にミトコンドリアの断片化が観察された。これに対して減数分裂前のG２期にミトコンドリアが連なったネットワークが形成され、それが断片化することなく分裂期に進行するのが観察された。分裂中期には微小管に依存して赤道面に集約、分裂後期にはセントラルスピンドル微小管構造の上に配列し、分裂終期に細胞質へ拡散した。その結果、娘細胞に均等分配される。減数分裂終了後の精細胞ではミトコンドリアの巨大凝集体が構築された。ミトコンドリアダイナミクスの意義を推定する目的でその融合、分裂を担う遺伝子をノックダウンすると、どちらの場合でも減数分裂期の細胞が観察できなかった。精母細胞の細胞周期が減数分裂前に停止していることがわかった。ミトコンドリアの ATP 合成阻害剤オリゴマイシンで細胞を処理したり、ミトコンドリア電子伝達系の構成因子をノックダウンしたりして、ATP合成を阻害しただけでは細胞周期の停止は観察されなかった。以上の結果から、ミトコンドリア の動態を監査して細胞周期を調節するチェックポイント機構の存在が予想された。細胞周期を分裂期に進行させるには、サイクリンBの合成とCDK1のリン酸化状態の変化が必要である。融合因子をノックダウンした状態でサイクリンBを強制発現させたところ、一部の細胞は分裂期に進行した。この結果は細胞周期停止の一因はサイクリンBの発現抑制である可能性が考えられた。
1: 当初の計画以上に進展している
当初は、H２６年度はショウジョウバエ雄減数分裂細胞の細胞周期進行に伴う、ミトコンドリア構造の変化を正確にとらえて記載すること、その分裂因子および融合因子のどちらをノックダウンして減数分裂開始が阻害されることを示すことまでを計画していたが、それに加えて、細胞周期停止の原因の一端をも推定できる結果が得られた。
今後は、精巣から単離した精母細胞をexo vivoで培養し、そのミトコンドリア構造の変化を生細胞を用いてライブ観察する。そしてミトコンドリアネットワーク形成、および減数分裂期における細胞内局在、減数分裂終了後にミトコンドリアの巨大凝集体が形成される様子を追跡観察する。ミトコンドリアダイナミクスの阻害による減数分裂サイクルの停止はサイクリンBの発現阻害がその一因であることが示されたが、本年度は阻害により、CDK１の抑制的リン酸化、活性化リン酸化が阻害されていないかについて検討する。CDK1のリン酸化サイトを改変した変異型タンパクを強制発現させたり、活性化を担う脱リン酸化酵素を強制発現させて、ミトコンドリアダイナムクスを阻害した際の細胞周期停止が解除されないか検討する。
精巣内の細胞を長時間ライブ観察できる ex vivo 実験系に必要な多数の系統を今年度は学部学生ボランティアの協力で維持することができた。ショウジョウバエ系統の維持、それに使用する飼料作製にかかる人件費は次年度に使用する予定である。連携研究者（ニコンCo.）のもとに出張し、超解像度顕微鏡を定期的に使用する予定であったが、サンプル調整が当初の計画以上に進んだため、出張回数が少なくて済み、出張旅費を次年度に使用する予定である。
H２６年度に作製したショウジョウバエ系統はH２７年度にも使用するので継続飼育する必要がある。H２７年度は学部学生のボランティアは望めないので、補助スタッフの雇用を増やして対応する。当初の計画よりも成果が得られているので、成果発表の機会を増やす予定である。H２６年度に使用しなかった旅費をこれに当てる。
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