| 研究課題/領域番号 |
26440190
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
堀 哲也 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (70550078)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | セントロメア / ヒストン修飾 / エピジェネティクス |
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| 研究実績の概要 |
これまでの研究から、各種ヒストン修飾抗体を利用した網羅的ChIP-seq解析を行ない、セントロメア特有なヒストンCENP-Aと極めて良く似たピークパターンを示す複数のヒストン修飾を見いだしている。平成26年度において、そのうちの一つの修飾「ヒストンH4の20番目のLys残基のモノメチル化（H4K20me1）」が、機能的なセントロメア形成に必須であることを明らかにした。さらに、このヒストン修飾導入に関連することが示唆されたモノメチル化修飾酵素(HMTx)の条件的遺伝子破壊株の樹立をニワトリDT40細胞で行っていた。平成27年度では、このHMTxの遺伝子破壊株を用いて、H4K20me1修飾のセントロメア領域への導入に与える影響を解析した。その結果、HMTx遺伝子破壊によりセントロメア領域のH4K20me1修飾が著しく減少することが明らかとなった。よって、このモノメチル化修飾酵素HMTxがセントロメア領域のH4K20me1修飾の導入に関与することが示唆された。
セントロメア領域に存在するヒストン修飾として見いだしていたヒストンH4の２種類のアセチル化修飾についても注目して解析を行った。生化学的解析の結果、この２種類のアセチル化修飾は主に、クロマチンへ取り込まれる前のCENP-A-ヒストンH4複合体に導入されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究期間中に明らかにする点として「セントロメア領域に特有なヒストン修飾が導入される意義」の解明を挙げた。これまで、予備的な実験から見いだしていた「セントロメア領域に特有な複数のヒストン修飾」の中の一つ「H4K20me1修飾」について、セントロメア形成における生物学的な意義を明らかにし、モデルとして報告した。また、研究実施計画で平成27年度に予定していた遺伝子破壊細胞株を利用した解析により、セントロメア領域のH4K20me1修飾の導入に関与する酵素の特定を行った。本成果は、セントロメア領域へのH4K20me1修飾の導入メカニズム解明の鍵となる知見である。加えて、ヒストンH4の２種類のアセチル化修飾は、主にクロマチンへ取り込まれる前のCENP-A-ヒストンH4複合体に導入されることを明らかにした。本成果は、セントロメアクロマチンに取り込まれる前のヒストン修飾の重要性に迫るきっかけとなる知見と考えている。以上の理由により、概ね順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に特定したセントロメア領域にH4K20me1修飾を導入する酵素HMTxに関連した研究およびヒストン修飾の構造基盤の解明に焦点を絞り、以下３項目について研究を推進する。
1. HMTxの遺伝子破壊株の解析：HMTxの遺伝子破壊により、染色体分配異常や各種セントロメアタンパク質の局在異常を解析し、ヒストン修飾の意義を調べる。さらに、HMTxの遺伝子破壊によるセントロメア領域のヒストン修飾パターンの変化を、クロマチン免疫沈降と次世代型シーケンサーによる解析（ChIP-Seq法）により調べる。次世代型シーケンサーによる解析は、国立遺伝学研究所の豊田敦特任准教授の協力のもと行ない、得られた大量データの情報解析は、国立遺伝学研究所の池尾一穂准教授の協力を仰ぐ。
2. HMTxと相互作用する因子の探索：FLAG タグを融合したHMTxを細胞内で発現させ、抗FLAG抗体による共免疫沈降法によりHMTxを含む複合体を精製する。あるいは、ビオチン付加酵素タグBirAを融合したHMTxを細胞内で発現させ、相互作用あるいは近接する因子をビオチン標識し、プルダウン法により濃縮精製する。精製した相互作用因子の同定は、北海道大学の小布施力史教授の協力のもと高感度質量分析により行なう。
3. 動原体構築におけるヒストン修飾の構造基盤の解明：セントロメアに特有な修飾を導入した修飾化ヒストンペプチドと、リコンビナント動原体タンパク質との直接的な相互作用の有無を、プルダウン実験やITC（等温滴定型カロリメーター）を活用して解析する。更に、修飾を含んだヒストンを用いてヌクレオソームを再構成して、動原体タンパク質複合体との結合実験も行なう。これら研究を推進し得られた結果を踏まえて、セントロメア領域におけるヒストン修飾の生物学的な意義について考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
規模を拡大して行う計画だったクロマチン免疫沈降と次世代型シーケンサーによる解析（ChIP-Seq法）を縮小し、セントロメア領域にH4K20me1修飾を導入する酵素の特定およびヒストンH4の２種類のアセチル化修飾の生化学的解析に研究の重点を変更した。その結果、クロマチン免疫沈降法における生化学実験で使用するヒストン修飾抗体、免疫沈降ビーズおよび次世代型シーケンサーに供するサンプル調整に必要な各種分子生物学実験試薬の購入を縮小した。以上の理由により次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
平成27年度に特定したセントロメア領域にH4K20me1修飾を導入する酵素HMTxの遺伝子破壊株を用いて、遺伝子欠損によりセントロメア領域のヒストン修飾パターンが変化するかどうかを、ChIP-Seq法により行う計画である。この際、クロマチン免疫沈降法における生化学実験で使用するヒストン修飾抗体、免疫沈降ビーズおよび次世代型シーケンサーに供するサンプル調整に必要な各種分子生物学実験試薬の購入に使用する計画である。さらに、HMTxを含む複合体の精製を共免疫沈降法およびプルダウン法により行う計画である。この際、複合体の精製で使用する免疫沈降ビーズおよびプルダウン実験に必要な生化学実験試薬の購入に使用する計画である。
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