抵抗性タンパク質の活性化機構と立体構造の解明

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26450055
• 研究機関: 奈良先端科学技術大学院大学
• 研究代表者: 河野 洋治 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 客員准教授 (00406175)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: イネ / 進化 / 遺伝子 / 耐病性

研究実績の概要

多くの抵抗性遺伝子は、nucleotide binding site-leucine rich repeat (NB-LRR)型のタンパク質をコードしており、細胞内型レセプターであることが明らかになった。動物のNB-LRR型タンパク質も免疫に関与する細胞内レセプターとして働くことが知られている。動物のNB-LRR型タンパク質Apaf-1では、活性化は各ドメインの分子内結合、リガンド認識後のNBドメインに結合したヌクレオチドの交換反応、分子間結合の３つの要素によって決定される。しかしながら、植物のNB-LRR型の抵抗性タンパク質の活性化と、各ドメインの分子内/間結合やNBドメインのヌクレオチドの状態との関連はほとんど解析されていない。さらに、全長の抵抗性タンパク質の立体構造解析の報告は１つもない。抵抗性タンパク質は、植物において最強の免疫応答を誘導する重要な細胞内免疫レセプターであるにも関わらず、全長の抵抗性タンパク質を精製することが困難なことから、シグナル伝達機構や活性化機構はほとんど明らかになっていない。申請者らは、イネいもち病菌の抵抗性タンパク質Pitのリガンド AvrPitと下流のシグナル分子 OsSpike1を同定している。本研究では、抵抗性タンパク質 Pitの精製系を確立し、生化学解析と立体構造解析を駆使して、Pitの活性化機構を明らかにする。さらに、得られた知見を利用して、Pitのリガンド AvrPit認識後の活性化から、下流分子OsSpike1活性化に至るメカニズムの全過程を明らかにすることを目的とする。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、抵抗性タンパク質Pit-1とその相互作用分子Pit-2の解析を通し、Pit-1, Pit-2による免疫制御機構を理解することを試みた。本研究で、生化学的な解析とYeast-two-Hybrid解析から、Pit-1がホモダイマーを形成すること、Pit-1とPit-2がヘテロダイマーを形成することを確認した。また、イネプロトプラストでの蛍光タンパク質で標識したPit-2の一過的発現、Agroinfirtration法を用いたN.benthamianaでの一過的発現Immunoblottingにより、Pit-2はPit-1と比較して細胞内での安定性が低い可能性が示唆された。更に、Pit-1はPit-2と共発現させることで検出されるタンパク質が増加し、Pit-2がPit-1の安定性に寄与することが示唆された。また、Pit-1によって誘導される細胞死における各種Pit-2変異体の効果を検討したところ、スイッチドメインと考えられているNB-ARCドメインのMHDモチーフに変異を加えたPit-2変異体が、特異的に活性型Pit-1による細胞死誘導を抑制することを見出した。以上の結果から、Pit-1とPit-2は細胞内でヘテロダイマーを形成し、互いにタンパク質の安定性や活性を調節してペア抵抗性タンパク質として働く可能性があると推測された。
以上のように新規の知見が得られており、おおむね順調に進展している。

今後の研究の推進方策

本研究では、生化学解析と立体構造解析を駆使して、現在まで不明である抵抗性タンパク質 Pitのリガンド認識後の活性化から、下流分子OsSpike1活性化までの全過程を明らかにすることを目的とする。具体的には、抵抗性タンパク質Pitの全長タンパク質の精製系を立ち上げて[研究計画 1]、Pitの不活性化型と活性化型のヌクレオチドの状態[研究計画 2]、分子内結合と分子間相互作用を明らかにする[研究計画 3].次に、抵抗性タンパク質がリガンドを認識した際に、不活性化状態から活性化状態にどのように遷移するかを明らかにする[研究計画 4]。立体構造解析では、１）抵抗性タンパク質Pitの立体構造、２）Pitのリガンドである AvrPitとPitの複合体の立体構造、３）OsRac1の活性化分子でありPitの下流のシグナル分子でもある OsSpike1と Pitの複合体の立体構造の順に明らかにする[研究計画 5]。

研究成果

• [雑誌論文] The RhoGAP SPIN6 Associates with SPL11 and OsRac1 and Negatively Regulates Programmed Cell Death and Innate Immunity in Rice. (2015)
  • 著者名/発表者名: Liu, L., Park, CH., He, F., Nagano, M., Wang, M., Bellizzi, M., Zeng, X., Liu, W., Ning, Y.,Kawano, Y., and Wang, GL.
  • 雑誌名: PLoS Pathog. 巻: 11 ページ: e1004629.
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1004629
  • 査読あり
• [雑誌論文] Rho family GTPase-dependent immunity in plants and animals. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kawano Y, Kaneko-Kawano T, Shimamoto K.
  • 雑誌名: Front Plant Sci. 巻: 5 ページ: 522
  • DOI: 10.3389/fpls.2014.00522
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] The crystal structure of the plant small GTPase OsRac1 reveals its mode of binding to NADPH oxidase. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kosami K, Ohki I, Nagano M, Furuita K, Sugiki T, Kawano Y, Kawasaki T, Fujiwara T, Nakagawa A, Shimamoto K, Kojima C.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 289 ページ: 28569-78
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.603282
  • 査読あり
• [雑誌論文] The NB-LRR proteins RGA4 and RGA5 interact functionally and physically to confer disease resistance. (2014)
  • 著者名/発表者名: Cesari S, Kanzaki H, Fujiwara T, Bernoux M, Chalvon V, Kawano Y, Shimamoto K, Dodds P, Terauchi R, Kroj T.
  • 雑誌名: EMBO J. 巻: 33 ページ: 1941-59
  • DOI: 10.15252/embj.201487923
  • 査読あり
• [雑誌論文] Palmitoylation-dependent membrane localization of the rice resistance protein pit is critical for the activation of the small GTPase OsRac1. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kawano Y, Fujiwara T, Yao A, Housen Y, Hayashi K, Shimamoto K.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 289 ページ: 19079-88
  • DOI: 10.1074/jbc.M114.569756
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] α-Taxilin interacts with sorting nexin 4 and participates in the recycling pathway of transferrin receptor. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakane H, Horii Y, Nogami S, Kawano Y, Kaneko-Kawano T, Shirataki H.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 9 ページ: e93509
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0093509
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 抵抗性タンパク質Pitは、OsSPIKE1を介した低分子量Gタンパク質OsRac1活性化により耐病性を制御する (2015)
  • 著者名/発表者名: 河野洋治、島本功
  • 学会等名: 第56回日本植物生理学会年会
  • 発表場所: 東京農業大学（東京都、世田谷区）
  • 年月日: 2015-03-16 – 2015-03-16
• [備考] PSC
  • URL: http://www.psc.ac.cn/research_personal.asp?id=144&Yoji%20Kawano
• [備考] Kawano lab
  • URL: http://sti-lab.org