| 研究課題/領域番号 |
26450075
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
田中 真幸 東京大学, 農学生命科学研究科, 特任助教 (80546292)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 上流ORF / ホウ素 / 輸送体 / シロイヌナズナ / 転写後制御 / リボソーム |
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| 研究実績の概要 |
ホウ素は植物にとって必須な無機栄養素であるが、過剰は植物にとって毒である。モデル植物であるシロイヌナズナの土壌からの効率的なホウ素の吸収にはホウ酸輸送体であるNIP5;1が必須であり、その発現は転写後制御を受けている。さらにその制御の上流において、リボソームが重要な役割を果たしていることが明らかとなってきた。本研究では、リボソームmRNA複合体による植物のホウ素濃度感知機能の解明を目的とした。
１）NIP5;1の5'非翻訳領域（5'-UTR)に存在する最小上流ORF、AUGUAA配列を介して、ホウ素依存的にリボソームが停滞し、それに伴ってmRNA分解が促進されることが明らかとなっており、これらの制御に関わる因子を同定するため、NIP5;1のホウ素感知変異株の単離を行った。レポーター遺伝子、GPFの下流にNIP5;1を結合し、5'-UTRを含むNIP5;1プロモーター制御がで発現させた形質転換シロイヌナズナを作製し、塩基置換を誘発する変異誘起剤で処理を行い、ホウ酸十分条件でGFP蛍光が観察される個体を選抜した。３万株の種子から一次選抜、二次選抜を経て5株の候補遺伝子を得た。5株の内の2株のいおいて次世代配列解析を行い、変異の原因遺伝子の候補を絞りこんだ。
２）リボソームがホウ素依存的にNIP5;1 5’UTRに存在するAUGUAA上で停滞することが明らかとなってきたが、どのようにリボソームがAUGUAA上で停滞するのかは明らかとなっていない。そこで本研究では、AUGUAA上停滞しているリボソームの立体構造を解析することにした。NIP5;15'-UTRのAUGUAA周辺配列、60塩基を用い、小麦胚芽抽出液を用いてin vitro 翻訳を行い、AUGUAA上で停滞しているリボソームRNAコンプレックスの精製を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）得られた候補遺伝子、5株の内すでに2株は次世代配列解析を行い、変異の原因遺伝子の候補を絞りこむことができた。現在他の3株についても次世代配列解析を行う準備をすすめており、次年度には全ての候補遺伝子において、変異の原因遺伝子の候補を絞りこむ予定である。これらの変異株は独立なM2集団から単離されたものであり、NIP5;1のホウ素感知に関わる、複数の植物材料の取得が達成された。
２）NIP5;1mRNAの5'-UTRに存在するAUGUAA配列上で停滞するリボソームを精製する方法を確立した。現在、低温電子顕微鏡を用いた立体構造解析を行うための準備に着手している。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）変異の原因遺伝子候補のアリルを取得し、NIP5;1のmRNA蓄積を確認し原因遺伝子の特定を行っていく。
２）低温電子顕微鏡を用いた立体構造解析を行うために必要な量のリボソームを精製し、まずは、精製試料をネガティブ染色で電子顕微鏡観で観察し、リボソーム複合体が形成されているかを観察する。その後、低温電子顕微鏡を用いAUGUAA上で停滞したリボソームの立体構造を解析していく。まずは分解能を低く設定し、リボソーム複合体にリリースファクターなどのタンパク質が結合しているかどうかを観察する。その後、分解能を高くし、リボソームがホウ素によって形態が変化しているかどうか、観察していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
NIP5;1のホウ素感知変異株の単離の実験において、当初の予定では、得られた候補遺伝子、5株すべての株に関して次世代配列解析を行い、変異の原因遺伝子の候補を絞む予定であったが、二次スクリーニングや得られた変異株と親株との掛け合わせなどに時間がかかり、今年度は2株のみ次世代配列解析を行ったために、次年度の使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度には残りの3株について、次世代配列解析を行う予定であり、それに充てる予定にしている。
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