| 研究課題/領域番号 |
26450079
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
三宅 親弘 神戸大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (80294289)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 光合成 / カルボニル / 高CO2 / グリオキサラーゼ / シアノバクテリア / 植物 |
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| 研究実績の概要 |
（１）高等植物での葉緑体局在グリオキサラーゼの発見
ジカルボニル解毒の全容を明らかにするために、アルドケトレダクターゼ(AKR)と比較し、メチルグリオキサール解毒に特化しているグリオキサラーゼ(GLO)の存在とその生理機能解明を試みた。その結果、シロイヌナズナゲノムに、GLO1とGLO2遺伝子を見出した。GLO1の細胞内局在解析を行ったところ、葉緑体に存在していた。さらに、その遺伝子産物の触媒能力は、これまで報告されているヒト型GLO1の触媒能力に匹敵した。現在、シロイヌナズナで、GLO1が欠損した変異株の生理解析を野生型と比較することにより行っている。
（２）高等植物での葉緑体局在グリオキサラーゼの機能解析
GLO1欠損シロイヌナズナ(delta-GLO1)と野生型の生育比較を行ったところ、delta-GLO1の生育が大気CO2/O2条件下、野生型よりも遅延することを見出した。それぞれの植物生葉から、タンパク質を抽出し、MGを代表とするカルボニル化合物による修飾をSDS-PAGEその後の修飾部位検出抗体を用いて調べた結果、野生型と比べてdelta-GLO1では修飾タンパク質の数、およびその修飾度の増加を認めることができた。さらに、光合成が盛んになる高CO2環境下で野生型およびdelta-GLO1を生育させたところ、delta-GLO1GLO1の生育は、大気条件よりもさらにその生育が抑制された。また、野生型と比べてdelta-GLO1GLO1では修飾タンパク質の数、およびその修飾度の増加も同様に認めることができた。これらの結果は、光合成の促進がジカルボニル生成を促し、生育抑制に至る障害をもたらしていることを示唆する。そして、野生型においてはGLO1によるジカルボニル解毒が行われていることが考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究実績で述べた課題について、以下達成度を記す。
（１）高等植物でのグリオキサラーゼ解毒機構の解明：本年度、グリオキサラーゼ・ファミリーの全容解明を行い、それぞれの酵素の特質を明らかにした。しかしながら、細胞レベルでの、局在性、発現制御など、解明すべき課題（生理学的）は残る。
（２）高等植物でのグリオキサラーゼ機能解析：グリオキサラーゼ・ファミリーのそれぞれの酵素を欠失したシロイヌナズナ・タグラインを入手し、生理学的解析を開始した段階です。これらタグラインの詳細な解析が不可欠である。
（３）高等植物イネでのグリオキサラーゼ欠損株の作出：本年度、作物であるイネでのグリオキサラーゼの機能を解明することを目的に、GLO1のRNAi植物の作出に着手した。その結果、GLO1活性が約２０％、および３０％へ低下した変異株の作出に成功した。次年度、生理・生化学解析を行っていく予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
計画２年目に当たる平成２７年度は、これまでと同様に以下の項目の課題遂行に取り組む。
（１）高等植物での糖アルデヒド（メチルグリオキサールMG）解毒機構の解明：MGおよび他の糖アルデヒド無毒化に関わるグリオキサラーゼ遺伝子の候補を、新たにデータベース上で見いだしている。本年度は、これら候補遺伝子の取得および遺伝子産物の酵素学的解析を行い、グリオキサラーゼとのアルデヒド無毒化の比較解析を行う。
（２）高等植物でのグリオキサラーゼ機能解析：取得したシロイヌナズナ・タグラインを用いて、高CO2環境下でのアルデヒドによる細胞障害の評価、光合成・呼吸さらに成長への影響評価を行う。予備的解析では、グリオキサラーゼ・ファミリーの１つが欠損したタグラインでは、高CO2環境下での生育が大きく抑制されることを見出している。このタグラインを中心に、生化学・生理学・分子生物学的解析を推進する。
（３）ランソウでの糖アルデヒド（メチルグリオキサールMG）解毒機構の解明：グリオキサラーゼ欠損ラン藻を用いて、ランソウでのアルデヒド代謝の全容解明を行うべく、様々な環境にランソウを暴露し、アルヒデヒドによるタンパク修飾、遺伝子発現の確認を行う。さらに、光合成・呼吸へダメージの生理学的影響へのグリオキサラーゼの関わりを探索していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（１）平成２６年度に行った葉緑体局在グリオキサラーゼ(GLO1)の検証は、既存のGFP結合タンパク質の細胞内発現システムを利用することができ、新規な発現システムの構築に資金を必要としなかったため。（２）平成２６年度に行ったGLO1の機能解析では、GLO1欠損シロイヌナズナ(delta-GLO1)の生育比較を野生型に対して行った。我々は、delta-GLO1が示す生育不良の原因解明のために、細胞内でのカルボニルにより修飾されたタンパク質の量およびカルボニル量などを比較解析した。これらの解析に要した資金が計上されている。（１）および（２）のために、計上金額となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
前年度の繰越金と合わせて、以下の研究を行う。（１）高等植物でのグリオキサラーゼ(GLO)機能解析：GLOを欠損したシロイヌナズナ・タグラインを用いて、高CO2環境下でのアルデヒドによる細胞障害の評価、光合成・呼吸さらに成長への影響評価を行う。このタグラインを中心に、生化学・生理学・分子生物学的解析を推進する。そこでは、カルボニル修飾タンパク質の同定のための２次元電気泳動解析、その後の質量分析によるタンパク質の同定、さらに、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイル解析を行う。これらのために、本年度の資金の申請および繰越金の活用を行う。（２）ランソウでの糖アルデヒド（メチルグリオキサールMG）解毒機構の解明：グリオキサラーゼ欠損ラン藻を用いて、ランソウでのアルデヒド代謝の全容解明を行うべく、様々な環境にランソウを暴露し、アルヒデヒドによるタンパク修飾、遺伝子発現の確認を（１）と同様に行う。
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