還元的モノづくりを指向する酢酸菌の遺伝子工学：細胞内ニコチンアミド系補酵素の制御

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26450095
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 藥師 寿治 山口大学, 創成科学研究科, 准教授 (30324388)
• 研究分担者: 松下 一信 山口大学, 創成科学研究科, 教授(特命) (50107736)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 酢酸菌 / 発酵 / 応用微生物 / 酵素 / バイオテクノロジー

研究実績の概要

酢酸菌はソルビトールからのソルボース発酵などのように，そのユニークな酸化的物質変換能が利用され，また研究も行われてきた。一方，酢酸菌は細胞内物質代謝もユニークなところがあるが，その点はほとんど顧みられることがなかった。本研究では，酢酸菌の細胞内代謝に着目し，逆転の発想ともいえる「酢酸菌による還元的物質生産」を行おうとするものである。
Gluconobacter属酢酸菌は，TCAサイクルと解糖系（EMP）が不完全で，糖代謝のほとんどをペントースリン酸経路に依存する。不完全なTCAサイクルのため，アセチルCoAへの代謝量が乏しく，最終代謝産物は二酸化炭素と酢酸となる。また，細胞膜のNADH酸化系呼吸鎖の活性は強いが，NADPH酸化活性はNADH酸化のそれの1-2％程度である。このことは，細胞内のNADPHレベルが高いことを期待させるが，実際には，NAD(H)の方がNADP(H)よりも多く，両者とも酸化型としての存在比が高い。
前年度までに，G. oxydans NBRC3293株の細胞表層型グルコース脱水素酵素（mGDH）の遺伝子破壊株を作製し，その解析を行ってきた。平成28年度は，野生株と変異株を用いてキナ酸からのシキミ酸生産試験を行った。この経路において律速になっているデヒドロキナ酸脱水酵素(DQD)とNADP+依存型シキミ酸脱水素酵素(SKDH)を同時に高発現する株の構築を試みた。構築した菌株を用いてシキミ酸生産を検討したが，シキミ酸はほとんど検出できなかった。酵素活性を確認したところ，DQDのみの高発現にとどまり，DQDとSKDHの同時高発現ができていなかった。DQD及びSKDHの単独での高発現はできているため，同時に高発現させることが困難であると示唆された。今後，この問題を克服し，mGDHの有無によるシキミ酸生産性の比較を行う。

研究成果

• [国際共同研究] ユーリッヒ研究所(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: ユーリッヒ研究所
• [雑誌論文] Membrane-bound glycerol dehydrogenase catalyzes oxidation of D-pentonates to 4-keto-D-pentonates, D-fructose to 5-keto-D-fructose, and D-psicose to 5-keto-D-psicose. (2017)
  • 著者名/発表者名: Ano, Y., Hours, R. A., Akakabe, Y., Kataoka, N., Yakushi, T., Matsushita, K. and Adachi, O.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 巻: 81 ページ: 411-418
  • DOI: 10.1080/09168451.2016.1254535
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Complete Genome Sequencing and Comparative Genomic Analysis of the Thermotolerant Acetic Acid Bacterium, Acetobacter pasteurianus SKU1108, Provide a New Insight into Thermotolerance. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsutani, M., Hirakawa, H., Hiraoka, E., Theeragool, G., Yakushi, T. and Matsushita, K.
  • 雑誌名: Microbes and Environments 巻: 31 ページ: 395-400
  • DOI: 10.1264/jsme2.ME16023
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Genomic analyses of thermotolerant microorganisms used for high-temperature fermentations. (2016)
  • 著者名/発表者名: Matsushita, K., Azuma, Y., Kosaka, T., Yakushi, T., Hoshida, H., Akada, R. and Yamada, M.
  • 雑誌名: Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 巻: 80 ページ: 655-668
  • DOI: 10.1080/09168451.2015.1104235
  • 査読あり
• [雑誌論文] Determination of Dehydrogenase Activities Involved in D-Glucose Oxidation in Gluconobacter and Acetobacter Strains. (2016)
  • 著者名/発表者名: Sainz, F., Jesus Torija, M., Matsutani, M., Kataoka, N., Yakushi, T., Matsushita, K. and Mas, A.
  • 雑誌名: Frontiers in Microbiology 巻: 7 ページ: 1358
  • DOI: 10.3389/fmicb.2016.01358
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] 酢酸菌Gluconobacter thailandicusにおける ジヒドロキシアセトン・リン酸化酵素の遺伝学的・生化学的解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 平田 花織，松谷 峰之介，足立 収生，片岡 尚也，薬師 寿治，松下 一信
  • 学会等名: 日本農芸化学会 2017年度大会
  • 発表場所: 京都女子大（京都府京都市）
  • 年月日: 2017-03-18 – 2017-03-20
• [学会発表] Gluconobacter属酢酸菌キノプロテイン・グリセロール脱水素酵素における新たな基質の発見とその反応メカニズムの提唱 (2017)
  • 著者名/発表者名: 寺田 優花，尾崎 聖士朗，片岡 尚也，足立 収生，赤壁 善彦，薬師 寿治，松下 一信
  • 学会等名: 日本農芸化学会 2017年度大会
  • 発表場所: 京都女子大（京都府京都市）
  • 年月日: 2017-03-18 – 2017-03-20
• [学会発表] Gluconobacter属酢酸菌由来膜結合型キナ酸脱水素酵素の高発現 (2016)
  • 著者名/発表者名: 小松和貴，藥師寿治，松谷峰之介，吉原望，片岡尚也，足立収生，松下一信
  • 学会等名: 日本農芸化学会 2016年度中四国支部大会
  • 発表場所: 高知大学（高知県高知市）
  • 年月日: 2016-09-15 – 2016-09-16
• [図書] Acetic acid bacteria: Ecology and Physiology (2016)
  • 著者名/発表者名: Edited by Matsushita, K., Toyama, H., Tonouchi, N., and Okamoto-Kainuma, A.
  • 総ページ数: 350 (273-297)
  • 出版者: Springer
• [備考]
  • URL: http://web.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~oubi/