| 研究課題/領域番号 |
26450098
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
九町 健一 鹿児島大学, 理工学域理学系, 准教授 (70404473)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 窒素固定 / 突然変異体 / 順遺伝学 / 遺伝子発現 / ゲルシフト |
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| 研究実績の概要 |
窒素固定とは大気中の窒素ガスをアンモニアに変換する反応だ。アンモニアは植物などの窒素養分となるので、生態系の維持に重要な役割を担う。窒素固定を行う生物種は、細菌のいくつかの分類グループに散在する。放線菌に属する窒素固定細菌フランキアは、理解のよく進んでいるプロテオバクテリア等の窒素固定種とは異なる特徴を示す。例えば、窒素固定専用の構造体（ベシクル）を分化する、窒素源の欠乏に応答して窒素固定遺伝子群の転写を活性化するしくみが他のバクテリアとは異なる、などである。本研究ではこれらの形質に関わる遺伝子を同定することを目的とし、窒素固定変異株の単離とその詳細な特徴付け、原因遺伝子の推定を行った。
17種の変異株について、ベシクル形成数と窒素固定遺伝子nifEHVの発現を調べたところ、7株ではベシクル形成数が、5株ではnif遺伝子の発現が、野生株と比較して大幅に低下していた。5株ではベシクルのサイズが小さかった。これらの表現型をもとに変異株を3つのグループに分類した。クラス1変異株は、ベシクル形成とnif遺伝子発現の双方に欠陥を示し、ベシクル分化と窒素固定関連遺伝子の両方の制御を同時に司る遺伝子が変異していると考えられた。クラス2変異株は、nif遺伝子発現のみに欠陥を示し、これらの遺伝子の転写制御に関わる遺伝子が変異していると考えられた。クラス3変異株は、ベシクル形成・nif遺伝子発現ともに大きな異常は示さないものの、窒素固定を行えなかった。恐らく、ベシクル膜の酸素防御機能に異常があると予想された。
変異原因遺伝子を同定するため、2種の変異株について復帰変異体を単離し、それらのゲノムを次世代シーケンスにより解析した。双方において、変異株と復帰株とで異なる塩基が見つかったことから、これらを含む遺伝子が変異表現型になんらかの関係を持つ可能性が考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
窒素固定変異株候補の表現型の詳細な解析を行った。調べた表現型は、液体培地での増殖速度、アセチレン還元活性、ベシクルの数と大きさ、窒素固定関連遺伝子（nifE、nifH、nifV）の発現である。18株（ニトロソグアニジン（NTG）由来の6株と、ガンマ線（GR）由来の12株）について行った。ベシクル数と遺伝子発現については、昨年度は定性的な解析にとどまっていたが、今年度は定量的な解析を行った。その結果、17株は窒素源を含まない液体培地での増殖とアセチレン還元活性に異常を示し、窒素固定能を失っていることが確認できた。野生株と比較して、7株ではベシクル数が、5株ではベシクルのサイズが、5株ではnif遺伝子の発現が大幅に低下していた。GR由来の2株についてはゲノム解析を行い、全ての変異塩基を特定した。昨年度解析したNTG由来の変異株より変異数が少なかった（1/10程度）。12株については2つの異なる培養液を用いた実験により表現型の再現性が取れたので、結果を論文にまとめた（近日投稿予定）。
変異原因遺伝子を同定するため、2つの変異株（N3H4株、G21E10株）について復帰変異体を単離し、それらのゲノムを次世代シーケンスにより解析した。変異株が持つ変異の中で、復帰変異株で野生型に回復しているものを探したところ、N3H4では9ヵ所、G21E10では10ヵ所見つかった。N3H4についてはサンガー法により確認を行ったところ、8ヵ所は変異株でも変異しておらず、次世代シーケンスのエラーだった。1ヵ所は6種の復帰変異株のうち、1株でしか野生型に戻っていなかった。
nif遺伝子の転写調節に関わるシス配列とトランス因子を同定するため、nifVのプロモーター上流配列を含むDNA断片をプローブとしてゲルシフト解析を行った。その結果、シフトが検出され、上流配列に結合する転写因子が存在する可能性が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
変異原因遺伝子を同定する。N3H4については、上述のとおり最も有望な変異がすべて原因ではなかった。しかし、変異株では野生型だが6種の復帰変異株ですべて変異型であるという、奇妙な挙動を示す塩基が存在した。もしかしたら、6種の株すべてで同一のサプレッサー変異が起きたのかもしれない。今年度は、液体培養により多様な復帰変異細胞をまとめて選択培養し、これらの混合ゲノムで当該の変異が起こっているかをサンガー法により確認する。G21E10についても、同様の方法で復帰変異細胞を選択・濃縮し、候補塩基の配列をサンガー法で確認することで、野生型に戻っているものを同定する。
ベシクルについては、サイズや形、ベシクル膜の厚さなどを定量的に計測することにより、それぞれの変異株がベシクル原基の形成から成熟に至るまでのどの段階に異常を示すかを推定する。
欠失変異や塩基置換を導入したnifVプローブを用いてゲルシフトを行い、トランス因子の結合部位を特定する。nifEおよびnifH遺伝子のプロモーター上流域のDNA断片を用いて競合実験を行うことにより、3つのnif遺伝子のプロモーター領域に同一のトランス因子が結合するかを調べる。また、窒素固定変異株から抽出したタンパク質を用いてゲルシフトを行い、シフトバンドの有無（トランス因子の有無）を調べる。
ベシクルの分化とnif遺伝子の発現は、アンモニアの欠乏に応答して活性化される。加えて、酸素の存在によりベシクル分化は活性化を、nif発現は抑制を受ける。各変異株がどの制御経路に欠陥を持つかを明らかにするために、まずは無酸素条件下でnif遺伝子の発現を調べる。
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