| 研究課題/領域番号 |
26450101
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| 研究機関 | 中央大学 |
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研究代表者 |
赤沼 元気 中央大学, 理工学部, 助教 (30580063)
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| 研究分担者 |
石塚 盛雄 中央大学, 理工学部, 教授 (50168241)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | Lipase / PHB / Ralstonia |
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| 研究実績の概要 |
高級アルコールによるリパーゼ発現誘導の促進因子であるEliAの機能を解明するため、まずその局在を観察した。その結果EliAは主に培養上清に局在しており、膜への局在はわずかであることが分った。この結果を受け、EliAが培養上清中で高級アルコールと相互作用する可能性を考え、精製EliAとステアリルアルコールの相互作用をin vitroで検討した。しかし、二者の間に有意な相互作用は観察されなかった。今後の条件検討が必要だが、EliAは高級アルコールに対して間接的に作用する可能性も考えられる。その一方で、eliA遺伝子の転写因子探索も試みた。eliA転写調節領域のDNAを固定したアフィニティーカラムを用いて相互作用するタンパク質を探索した結果、3種の候補タンパク質の同定に成功した。このうち1種のタンパク質にDNA結合ドメインが確認されたため、遺伝子破壊株の作製を試みている。
また、高級アルコールに対する細胞の反応全般を把握する目的で分泌・細胞質・膜タンパク質のプロテオーム解析を行った。本研究計画の申請後、分泌タンパク質のプロテオーム解析を優先して行い、リパーゼとEliA以外にもHcpやNdkなど感染に関与する分泌タンパク質の発現がステアリルアルコールによって転写レベルで誘導されていることを確認した。この結果は、ステアリルアルコールが感染に関与する遺伝子の発現を誘導することを示唆するものである。その一方で、ステアリルアルコールによって発現誘導される細胞質タンパク質を9種、膜タンパク質を2種同定することに成功した。細胞質に関してはストレス応答やアルコールの資化に関わるものが含まれ、膜に関しては物質輸送に関与するものが同定された。これらの中から、リパーゼの発現誘導に関与する可能性があるタンパク質を選択し、遺伝子破壊株の作製を試みている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
申請書では具体的な検討課題として以下の５点を挙げているが、どの項目においても本年度の研究計画を上回る進展が認められる。１． EliAの局在とステアリルアルコールとの相互作用検証； EliAの局在について抗体を用いて検証し、主に培養上清に存在することを確認した。さらに、精製EliAを用いた実験によりEliAがステアリルアルコールに間接的に作用する可能性が示唆された。２．eliAの転写制御機構解明； eliAの転写調節領域を固定したアフィニティーカラムを用いて転写因子の候補を３種同定し、そのうちのひとつにDNA結合ドメインを見出した。３．ステアリルアルコールによる分泌・細胞質・膜タンパク質の発現パターン変動観察； ステアリルアルコールによって発現誘導されるタンパク質を複数同定することに成功した。分泌されるものでは5種、細胞質では9種、膜に局在するものでは2種のタンパク質の発現量がそれぞれ増加することを見出した。さらに、これらのタンパク質をコードする遺伝子が転写レベルで誘導されていることを確認した。４．lipAとphaCABの転写制御機構解明；PHB生産を担う酵素群をコードするphaCABオペロンの転写解析を行い、ステアリルアルコールによるPHB生産誘導時においてもこのオペロンの転写量が変動しないことを観察した。恐らくステアリルアルコールの資化によって蓄積したアセチルCoAがPHB生産を誘導しているものと考えられる。その一方で、遺伝子破壊によってlipAの転写誘導効率が減少する転写因子候補を同定し、現在解析を進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
eliAの転写調節領域に結合すると考えられるタンパク質の遺伝子破壊株を作製し、ステアリルアルコールによるeliA転写誘導への影響を観察する。eliA転写への関与が認められた場合、このタンパク質を精製し、EMSAによって直接的な相互作用を確認する。一方、EliAの高発現がステアリルアルコールによるリパーゼ発現誘導効率に与える影響に関しても検証する予定である。さらに比較プロテオーム解析の結果から、アルコールの資化に関わる細胞質タンパク質や炭化水素の輸送に関わる膜タンパク質の発現誘導が確認されたので、これらのタンパク質をコードする遺伝子を破壊することでリパーゼ発現誘導への影響を検証する。また、遺伝子破壊がリパーゼ発現誘導に影響を与える新たな転写因子候補を見出しているので、このタンパク質を精製し、lipA転写調節領域への直接的な結合を証明するとともに、結合領域の決定を試みる。これらの計画に加え、細胞膜の変性がリパーゼの発現量を増加させている可能性を考慮し、ステアリルアルコール添加による膜流動性の変化を観察する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
30,000円程度の次年度使用額が発生した理由として、試薬・酵素類の購入額がわずかに少なかったことが挙げられる。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額に関しては、試薬・酵素類などの消耗品購入に充てる予定である。
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