放射線抵抗性細菌の遺伝子導入による高度好熱菌への放射線耐性付与

2015 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26450103
• 研究機関: 東洋大学
• 研究代表者: 鳴海 一成 東洋大学, 生命科学部, 教授 (90343920)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 遺伝子発現 / DNA修復 / 高度好熱菌 / 放射線抵抗性細菌 / タンパク質改変

研究実績の概要

カナマイシン耐性遺伝子マーカーを持つインテグレーションベクターpT8S-P31を用いて昨年度作製したDeinococcus geothermalis pprA遺伝子発現Thermus thermophilus（P31pprA株）と同様に、ハイグロマイシン耐性遺伝子マーカーを持つインテグレーションベクターpT8H5-Pslpを用いて、D. geothermalis pprA遺伝子をT. thermophilus HB27 HT104 (pTT8)株のゲノムに挿入し、PslppprA株を取得した。また、昨年作製したP31pprA株でゲノムに挿入したpprA遺伝子中にナンセンス変異が認められたため、P31pprA株も作製し直した。
また、D. geothermalis pprA遺伝子をpET系ベクターにクローニングし、N末端His-tag付きPprAタンパク質を大腸菌BL21(DE3)株で大量発現させた。0.5M アルギニン含有抽出バッファーに懸濁したPprA発現大腸菌を遠心して得られた沈殿を1 M アルギニン含有Tris-HClバッファーに再懸濁し、TALON Cobaltカラムを用いたイミダゾール濃度勾配によってPprAタンパク質を精製した。さらに、脱塩後の精製PprAタンパク質を用いて、抗D. geothermalis PprAウサギポリクローナル抗体を作製した。
次に、T. thermophilus P31pprA株及びPslppprA株におけるpprA遺伝子のゲノムからの発現を、抗D. geothermalis PprAポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにて解析した。その結果、培養温度50℃では、D. geothermalis PprAタンパク質 のT. thermophilusにおける良好な発現が観察されたが、培養温度55℃では、インタクトなD. geothermalis PprAタンパク質の著しい減少と分子量の小さい分解産物が認められた。また、培養温度60℃では、インタクトなD. geothermalis PprAタンパク質がほとんど観察されなかった。
これらのことから、高温培養条件下のT. thermophilus細胞中でD. geothermalis PprAタンパク質は、熱による変性と分解を受けていることが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

抗D. geothermalis PprAを作製することで、T. thermophilusにおけるPprAの発現状態の確認が可能となり、順調に計画を達成することができた。

今後の研究の推進方策

P31pprA株およびPslppprA株の各種変異原（ガンマ線、紫外線、マイトマイシンC、ブレオマイシン、過酸化水素など）に対する耐性を評価するとともに、pprA遺伝子にランダム変異を導入して、耐熱性の向上した変異タンパク質をスクリーニングする予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Homi Bhabha National Institute(インド)
  • 国名: インド
  • 外国機関名: Homi Bhabha National Institute
• [雑誌論文] Draft genome sequence of the radioresistant bacterium Deinococcus grandis, isolated from freshwater fish in Japan (2016)
  • 著者名/発表者名: Katsuya Satoh, Takefumi Onodera, Kota Omoso, Kiyoko Takeda-Yano, Takeshi Katayama, Yutaka Oono, Issay Narumi
  • 雑誌名: Genome Announcements 巻: 4 ページ: e01631-15
  • DOI: 10.1128/genomeA.01631-15
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] DNA gyrase of Deinococcus radiodurans is characterized as type II bacterial topoisomerase and its activity is differentially regulated by PprA in vitro (2016)
  • 著者名/発表者名: Swathi Kota, Vijaya K. Charaka, Yogendra S. Rajpurohit, Katsuya Satoh, Issay Narumi, Hari S. Misra
  • 雑誌名: Extremophiles 巻: 20 ページ: 195-205
  • DOI: 10.1007/s00792-016-0814-1
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] DNA repair in hyperthermophilic and hyperradioresistant microorganisms (2015)
  • 著者名/発表者名: Yoshizumi Ishino, Issay Narumi
  • 雑誌名: Current Opinion in Microbiology 巻: 25 ページ: 103-112
  • DOI: 10.1016/j.mib.2015.05.010
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Draft Genome Sequence of Methylobacterium sp. ME121, isolated from soil as a mixed single colony with Kaistia sp. 32K (2015)
  • 著者名/発表者名: Shun Fujinami, Kiyoko Takeda-Yano, Takefumi Onodera, Katsuya Satoh, Tetsu Shimizu, Issay Narumi, Akira Nakamura, Masahiro Ito
  • 雑誌名: Genome Announcements 巻: 3 ページ: e01005-15
  • DOI: 10.1128/genomeA.01005-15
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] たんぽぽ計画の進行状況：その全体像並びに微生物捕集及び曝露実験について (2016)
  • 著者名/発表者名: 横堀伸一、河口優子、田端誠、河合秀幸、奥平恭子、今井栄一、富田-横谷香織、林宣宏、鳴海一成、小林憲正、三田肇、薮田ひかる、癸生川陽子、佐々木聰、石橋之宏、東出真澄、橋本博文、矢野創、山岸明彦
  • 学会等名: 第16回宇宙科学シンポジウム
  • 発表場所: 宇宙科学研究所（神奈川県相模原市）
  • 年月日: 2016-01-06 – 2016-01-07
• [学会発表] 放射線抵抗性細菌Deinococcus grandisにおけるDNA修復応答制御遺伝子pprIの機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 黒澤飛翔、佐藤勝也、鳴海一成
  • 学会等名: BMB2015 (第38回日本分子生物学会年会第88回日本生化学会大会合同大会)
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（神戸市中央区）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] 放射線抵抗性細菌Deinococcus geothermalisにおけるpprA遺伝子の遺伝子破壊解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 島田岳、佐藤勝也、鳴海一成
  • 学会等名: BMB2015 (第38回日本分子生物学会年会第88回日本生化学会大会合同大会)
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド（神戸市中央区）
  • 年月日: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [学会発表] Current status on space exposure and capture experiments of microbes in TANPOPO mission at International Space Station (2015)
  • 著者名/発表者名: Shin-ichi Yokobori, Yuko Kawaguchi, Kaori Tomita-Yokotani, Nobuhiro Hayashi, Issay Narumi, Makoto Tabata, Hideyuki Kawai, Kyoko Okudaira, Yoko Kebukawa, Kensei Kobayashi, Hajime Mita, Kazumichi Nakagawa, Hikaru Yabuta, Eiichi Imai, Satoshi Sasaki, Masumi Higashide, Hirofumi Hashimoto, Hajime Yano, Akihiko Yamagishi
  • 学会等名: 第8回アストロバイオロジーワークショップ
  • 発表場所: 東京工業大学（東京都目黒区）
  • 年月日: 2015-11-27 – 2015-11-28
• [学会発表] 中高度好熱性及び放射線抵抗性を持つ多重極限環境微生物Deinococcus geothermalisにおけるpprA遺伝子破壊解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 島田岳、佐藤勝也、鳴海一成
  • 学会等名: 第16回極限環境生物学会年会
  • 発表場所: 東京海洋大学（東京都品川区）
  • 年月日: 2015-11-08 – 2015-11-09
• [学会発表] Deinococcus grandisにおける突然変異を誘発する遺伝子の機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 面曽宏太、佐藤勝也、鳴海一成
  • 学会等名: 第16回極限環境生物学会年会
  • 発表場所: 東京海洋大学（東京都品川区）
  • 年月日: 2015-11-08 – 2015-11-09
• [学会発表] 放射線抵抗性細菌におけるDNA修復応答制御遺伝子pprIの機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 黒澤飛翔、面曽宏太、竹島創、佐藤勝也、鳴海一成
  • 学会等名: 第16回極限環境生物学会年会
  • 発表場所: 東京海洋大学（東京都品川区）
  • 年月日: 2015-11-08 – 2015-11-09
• [学会発表] 宇宙環境下でのDeinococcus属の生存能力の検証（たんぽぽ計画） (2015)
  • 著者名/発表者名: 河口優子、Yinjie Yang、村野由佳、原田美優、川尻成俊、白石啓祐、高須昌子、高須昌子、鳴海一成、佐藤勝也、橋本博文、中川和道、谷川能章、田邊真依子、桃木洋平、杉野朋弘、吉田聡、横堀伸一、山岸明彦
  • 学会等名: 第16回極限環境生物学会年会
  • 発表場所: 東京海洋大学（東京都品川区）
  • 年月日: 2015-11-08 – 2015-11-09
• [学会発表] Thermococcus kodakarensis polB 遺伝子破壊株の熱感受性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 櫛田卓志、鳴海一成、石野園子、石野良純、藤原伸介、今中忠行、東端啓貴
  • 学会等名: 第16回極限環境生物学会年会
  • 発表場所: 東京海洋大学（東京都品川区）
  • 年月日: 2015-11-08 – 2015-11-09
• [学会発表] 放射線抵抗性細菌における細胞内ポリリン酸とセシウム蓄積の関連性 (2015)
  • 著者名/発表者名: 上田涼史郞、佐藤勝也、大野豊、林秀謙、鳴海一成
  • 学会等名: 第10回高崎量子応用研究シンポジウム
  • 発表場所: 高崎量子応用研究所（群馬県高崎市）
  • 年月日: 2015-10-08 – 2015-10-09
• [学会発表] イオンビーム育種技術による放射線抵抗性細菌のセシウム蓄積変異株の選抜 (2015)
  • 著者名/発表者名: 佐藤勝也、上田涼史郞、長谷純宏、大野豊、鳴海一成
  • 学会等名: 第10回高崎量子応用研究シンポジウム
  • 発表場所: 高崎量子応用研究所（群馬県高崎市）
  • 年月日: 2015-10-08 – 2015-10-09
• [学会発表] たんぽぽ計画における微生物並びに有機物宇宙曝露実験 (2015)
  • 著者名/発表者名: 横堀伸一、河口優子、癸生川陽子、富田－横谷香織、林宣宏、鳴海一成、中川和道、今井栄一、矢野創、橋本博文、三田肇、小林憲正、山岸明彦
  • 学会等名: 第59回宇宙科学技術連合講演会
  • 発表場所: かごしま県民交流センター（鹿児島県鹿児島市）
  • 年月日: 2015-10-07 – 2015-10-08
• [学会発表] Efficient and accurate repair mechanisms of DNA double-strand breaks in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans (2015)
  • 著者名/発表者名: Issay Narumi
  • 学会等名: The International Symposium on Life Sciences, Toyo University
  • 発表場所: 東洋大学（東京都文京区）
  • 年月日: 2015-09-18
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Deinococcus grandisにおける突然変異を誘発する遺伝子の機能解析 (2015)
  • 著者名/発表者名: 面曽宏太、佐藤勝也、鳴海一成
  • 学会等名: 変異機構研究会第28回夏の学校
  • 発表場所: 知県小牧勤労センター（愛知県小牧市）
  • 年月日: 2015-07-25
• [学会発表] 宇宙環境下でのDeinococcus属細菌の生存可能性? ISSにおける「たんぽぽ」ミッションの宇宙曝露実験に向けて (2015)
  • 著者名/発表者名: 村野由佳、原田美優、河口優子、橋本博文、小林憲正、中川和道、鳴海一成、佐藤勝也、吉田聡、矢野創、横堀伸一、山岸明彦
  • 学会等名: 日本地球惑星科学連合2015年大会
  • 発表場所: 幕張メッセ（千葉県千葉市）
  • 年月日: 2015-05-22 – 2015-05-26
• [備考] 東洋大学 放射線微生物学研究室
  • URL: http://www2.toyo.ac.jp/~narumi/