| 研究課題/領域番号 |
26450106
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| 研究機関 | 崇城大学 |
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研究代表者 |
岡 拓二 崇城大学, 生物生命学部, 准教授 (50510690)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 糸状菌 / 糖鎖 / ガラクトフラノース / 細胞壁 / 抗真菌剤 |
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| 研究実績の概要 |
平成27年度は、大腸菌を宿主として発現および精製した組換えGfsAを用いることでGfsAの詳細な酵素機能を決定した。まず、受容基質となるpNP-β-Galfと糖供与体となるUDP-β-GalfをGfsAを用いて反応させることでpNP-β-Galf-Galfを合成した。合成したpNP-β-Galf-Galfを分離精製することで500ug程度調製した。得られたpNP-β-Galf-GalfをNMR解析に供したところ、pNP-β-Galf-GalfはpNP-β-Galf-β1,5-Galfであることが明らかになった。すなわち、GfsAはGalf残基にGalfをβ1,5-結合で転移するガラクトフラノース転移酵素であることが明らかになった。また、GfsAの最適反応条件を決定した。その結果、GfsAは最適反応温度 20-30度、最適反応pH6.5-7.5であることが明らかになった。また、A. nidulansのGfsAに関しては部位特異的変異導入法を用いて22種類の1アミノ酸置換体を作製した。各変異体をgfsA破壊株内で発現させることで、gfsA遺伝子破壊によって引き起こされる生育阻害がどの程度回復するのかを観察することで各変異体の酵素機能を解析した。532アミノ酸から構成されるGfsAのうち、256-258番目に存在するDXDモチーフよりC末端方向に約100アミノ酸の領域に酵素活性保持に重要なアミノ酸が集中していることが明らかになった。
GfsAと似たアミノ酸配列を有するGfsD-GfsHについても大腸菌を宿主とした組換え体の作製に成功した。現在、これら組換え酵素についての酵素機能について解析を進めている。また、A. fumigatus におけるgfsABCの三重遺伝子破壊株を作製した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
計画では、今年度にGfsAの酵素特性についての解析を行い、来年度に遺伝子破壊株の構築を行う予定であったが、酵素の機能特性解析のみならず、各遺伝子の単独破壊株および多重破壊株も取得することが出来た。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、来年度はガラクトフラノース転移酵素遺伝子破壊株の表現型の解析を進めていく予定にしている。各遺伝子の破壊株および多重遺伝子破壊株よりガラクトマンナンを抽出、精製し、NMR解析およびメチル化解析を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
糸状菌プロトプラストの調製に必要なLysing Enzymeという製品を購入する際にキャンペーンが行われており、予定より安く購入することが出来たため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
来年度に必要なオリゴDNAの購入（物品費）として使用させて頂く予定にしている。
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