研究課題
糸状菌ゲノムの「膨大な数の二次代謝遺伝子群」の役割と環境シグナル伝達系による制御メカニズムを明らかにし、糸状菌の膨大な能力の効率的制御・利用を可能にするため、本年度はテヌアゾン酸の生合成遺伝子の同定と解析等を行った。テヌアゾン酸はイネいもち病菌が生産する二次代謝産物であり、ポリケチドとアミノ酸（イソロイシン）の融合化合物である。テヌアゾン酸がDMSO処理及びp38 MAPK遺伝子破壊により生産誘導されることを明らかにしていたため、生産条件と非生産条件の全RNAを用いてDNAマイクロアレイ解析を行うことにより生合成遺伝子の候補を絞り込み、遺伝子破壊により生合成酵素遺伝子を確定させた。テヌアゾン酸生合成遺伝子は新たなタイプの二次代謝産物生合成酵素をコードしていた。具体的には、非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）の後にポリケチド合成酵素（PKS）のKSドメインが続くユニークな構造の酵素であった。テヌアゾン酸生合成酵素遺伝子破壊株はイネに対する病原性が低下せず、テヌアゾン酸は感染には必須ではないことが明らかになった。我々は既に、テヌアゾン酸がイネいもち病防除効果を示すことを見出しており、テヌアゾン酸はむしろ感染を抑制する化合物であることが明らかとなった。環境シグナル伝達系因子の遺伝子破壊株と大量発現株を用いた解析により、二つのMAPK（PMK1、MPS1）及び光応答情報伝達系因子LaeAの大量発現株でテヌアゾン酸の生産誘導が引き起こされることを見出していた。生産誘導メカニズムを明らかにするためにそれぞれの株から全RNAを精製してRNA-seqによる解析を行い、テヌアゾン酸の生合成遺伝子以外にも発現誘導される遺伝子があることを見出した。
2: おおむね順調に進展している
本年度は二次代謝遺伝子の役割の解析を行うことと既知の環境シグナル伝達系の二次代謝制御への関与を明らかにすることを目的にした。独自に見出したテヌアゾン酸の生産誘導条件と非生産条件の遺伝子発現の比較からテヌアゾン酸生合成遺伝子を絞り込み、それに続く解析で遺伝子を同定することに成功した。テヌアゾン酸の生合成遺伝子はユニークな構造の新たなタイプの二次代謝産物生合成酵素をコードしていた。また、テヌアゾン酸がイネへの感染には必要とされないことを明らかにした。更に、テヌアゾン酸生産誘導が引き起こされる環境シグナル伝達系因子大量発現株における遺伝子発現を網羅的に解析し、テヌアゾン酸生合成遺伝子以外にも発現誘導される二次代謝遺伝子があることを見出した。以上のように、おおむね順調に研究が進展していると考える。
今後は本年度の続きの研究を行うとともに、未知の二次代謝制御系の探索を行う。化合物ライブラリー（理研天然化合物バンクNPDepo）を用いて二次代謝を制御する化合物を探索し、その標的を化合物ビーズで探索し、新たな二次代謝制御タンパク質を同定する。まず、天然化合物ライブラリー（NPDepo）からの二次代謝制御化合物の探索を行う。NPDepo化合物の中から、二次代謝産物生産を変化させるものを取得し、ヒット化合物については、NPDepo等から類縁構造化合物を入手し、評価し、より活性が高い化合物を取得する。次に、二次代謝制御化合物の標的タンパク質の同定を行う。ヒット化合物がどの遺伝子を制御するのか、相乗効果を示すか等を調べ、クラス分けする。クラスの代表化合物の化合物ビーズカラムを作製し、標的のアフィニティー精製と同定を行う｡標的候補の遺伝子破壊で化合物処理と同様の効果が現れるかどうか等を見て、標的を確定させる。更に、二次代謝制御化合物が制御する二次代謝産物と生合成遺伝子の同定を行う。化合物で生産制御されている二次代謝産物を解析し、未知の代謝産物の場合は、精製し構造決定を行う。生産制御されている二次代謝産物の生合成遺伝子クラスターを同定する際は、二次代謝産物の構造と遺伝子発現パターンから生合成遺伝子を絞り込み、遺伝子破壊等により生合成遺伝子を確定させる。
次年度使用額が99,968円生じた。本年度、テヌアゾン酸の生合成遺伝子の同定に成功したが、ユニークな構造の新しいタイプの酵素をコードしていたためその解析を優先させた｡そのため、遺伝子操作に充てる研究費が当初の予定より減少し、次年度使用額が生じた。
次年度は、当初の予定より遺伝子操作関連の実験が増加し、必要な研究費の総額が増加するため、次年度使用額99,968円を増加分にあてる。次年度に請求する研究費130万円とあわせて1,399,968円で次年度の研究を行う。約115万円で物品購入を行い、研究を遂行する。旅費の10万円で研究成果の発表を行う。その他の15万円で英文校閲等を行う。
すべて 2015 2014
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件、 謝辞記載あり 2件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 1件)
Letters in Applied Microbiology
巻: 59 ページ: 377-383
10.1111/lam.12289
Journal of Mass Spectrometry
巻: 49 ページ: 537-542
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