| 研究課題/領域番号 |
26450114
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
奥山 正幸 北海道大学, (連合)農学研究科(研究院), 講師 (00344490)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | スクロース類似体 / レバンスクラーゼ / グリコシダーゼ / スクロースシンターゼ |
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| 研究実績の概要 |
本研究は糖質を酵素を用いてフラクトフラノシル化することで結合エネルギーの高いスクロース類似体を合成すること、またそれらをグリコシダーゼもしくはスクロースシンターゼの糖供与体とすることで、様々な配糖体、糖ヌクレオチドを合成することである．
２６年度はBacillus subtilis由来のレバンスクラーゼを用いて、様々な糖質のフラクトフラノシル化することに成功した．どの糖質が、どの程度レバンスクラーゼの受容体になり得るのかということを反応速度論的に評価する方法を確立し、生成したスクロース類似体をアルカリ熱処理ならびにカラムクロマトグラフィーにより、単離精製する方を確立した．これらについては日本農芸化学会２０１５年度岡山大会にて報告した．今後は得られた手法を用いて大量にスクロース類似体の調製することを試みる．
一方で、Zymomonas属より、新たにレバンスクラーゼ、β－フラクトフラノシダーぜを取得し、基質特異性を評価した．
また生成したスクロース類似体を基質として、α－キシロシダーゼ、αーガラクトシダーゼ、α－アミラーゼ、およびデキストラナーゼを用いて、糖転移反応の基質となり得るのかを評価した．α－キシロシダーゼでは一部変異酵素を作成し評価し、またα－ガラクトシダーゼでは新たに、新しい酵素を取得し、その評価を行った．しかし、現在のところ有意な結果は得られておらず、今後の課題である．
さらにスクロースシンターゼcDNAを植物よりクローニングし、これを用いた組換えタンパク質生産系を確立した．部位特異的変異酵素を作製し、基質特異性の異なる酵素の創出を試みたが、現在までのところ、有意な結果は得られていない．しかし、これらの結果から構造と機能の相関を垣間見ることができ、今後のタンパク質工学的な研究に役立てたいと考えている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前述のとおり、B. subtilis由来のレバンスクラーゼを用いて、スクロース類似体を合成することについては予定通り達成した．当初の予定には、B. subtilis由来レバンスクラーゼの受容体特異性をタンパク質工学的に改変することが、含まれていた．しかし、２６年度、それを達成することができなかった．また非天然糖を有機化学的に合成するに至らなかった．
一方で、新たにZymomonas属より新たにレバンスクラーゼならびβ－フラクトフラノシダーゼを取得し、これらの基質特異性、糖転移能を評価することができ、B. subtilis由来の酵素とは異なる特異性を有することを明らかにすることができた．
また２６年度以降に実施する予定であった、各種グリコシダーゼによるスクロース類似体の評価、ならびにスクロースシンターゼの組換え酵素生産系・酵素活性測定法を確立することができ、この酵素のタンパク質工学的手法による基質特異性の改変に取り組むことができた．
これらを総合的に評価し、２６年度の達成度をやや遅れているとした．
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| 今後の研究の推進方策 |
２７年度は、レバンスクラーゼ、各種グリコシダーゼ、ならびにスクロースシンターゼのタンパク質工学的手法による基質特異性の改変について重点的に取り組んでいくつもりである．２６年度の遅れを取り戻すべく、レバンスクラーゼの改変について、まず重点的に行う予定である．レバンスクラーゼはマンノースを受容体とすることができない．これをタンパク質工学的に改変する．
グリコシダーゼについては、スクロース類似体を基質とする酵素の取得をタンパク質工学的に創出すること、また、新たなタンパク質を微生物、もしくは遺伝子データベース上からバイオインフォマティクス的に取得することも視野に入れて研究を進める．
スクロースシンターゼに関しては、スクロースアナログを基質とする酵素をタンパク質工学的に創出することをこれまで同様に行っていく．これまで得られた構造機能相関に関する知見をもとに行っていく予定である．また生成した糖ヌクレオチドを基質とする糖転移酵素を取得し、スクロースシンターゼとカップリングさせ、配糖体ならびオリゴ糖の生産に取り組んでいくつもりである．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
納品は3月末日までに終了しているが支払いが4月末支払いのため、差額が生じた．
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| 次年度使用額の使用計画 |
残りの金額を使った消耗品についてはすでに納品済みのため、4月末日にはすべての差額が支払われる予定である．
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