| 研究課題/領域番号 |
26450121
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
中川 寅 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (10281049)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | (プロ)レニン受容体 / プロセシング酵素 / プロテアーゼ / V-ATPase / ATP6AP2 / バイオマーカー |
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| 研究実績の概要 |
本研究は，臓器障害の新規バイオマーカーとして近年注目されている可溶型(プロ)レニン受容体（可溶型PRR）について，その産生機構を明らかにすることを目的としている。可溶型PRRは，膜結合型（全長型）PRRが細胞内プロテアーゼ（プロセシング酵素）によって特定部位で切断されて生成する。可溶型PRRを産生するプロセシング酵素として，これまでにfurinとADAM19が報告されているが，これらの働きでは十分に説明できないデータがある。本研究では，研究代表者が予想する第3のプロテアーゼが可溶型PRR産生に関わるプロセシング酵素である可能性を検証する。
平成26年度に実施した生化学的解析の結果から，可溶型PRR産生機構として，全長型PRRに候補プロテアーゼとfurinが段階的に作用するモデルが導かれた。そこで平成27年度，切断部位の異なるこれら２種類の可溶型PRRを識別するための切断部位特異的抗体を作製した。２つの抗体がそれぞれ意図した交叉性をもつことが，合成ペプチドを用いたELISA法，ならびに，大腸菌発現系で生産した組換え型可溶型PRRを用いたウェスタンブロット法によって確認された。そこで，ヒトPRR遺伝子を導入した細胞株CHO/hPRR-10Hisが産生する可溶型PRRを，両抗体を用いたウェスタンブロット法によって解析した。候補プロテアーゼによる予測切断部位を標的とする抗体は細胞内の可溶型PRRに反応したが，培地中の可溶型PRRには反応しなかった。このことから，候補プロテアーゼが関与する段階的プロセシングのモデルが支持された。しかし，furinによる予測切断部位を標的とする抗体は，細胞内と培地中のどちらの可溶型PRRとも反応しなかった。このことから，furinで切断されて生じたC末端部位は，さらに修飾されている可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は，可溶型(プロ)レニン受容体（可溶型PRR）の産生機構を明らかにすることを目的としている。申請時に本研究の成否の鍵を握る研究ツールとして位置付けていた「切断部位特異的抗体」を，本年度，作製した。合成ペプチドを用いたELISA法による評価，ならびに，大腸菌発現系で生産した組換え型可溶型PRRを用いたウェスタンブロット法による評価によって，意図した抗体の作製に成功したことが確認された。得られた抗体を用いて，ヒトPRRを発現する培養細胞を解析した結果，研究代表者が予想する候補プロテアーゼが可溶型PRR産生に関わるという，学術的な新知見を支持するデータが得られた。
全体的には，交付申請書に記載の研究計画に沿って，おおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度，作製した切断部位特異的抗体を用いた解析結果から，候補プロテアーゼとfurinによる段階的切断を経て生じた可溶型PRRのC末端部位が，さらに修飾されている可能性が示唆された。そこでまず，この修飾が，カルボキシペプチダーゼによるC末端Arg残基の除去である可能性を調べるため，siRNAを用いてカルボキシペプチダーゼをノックダウンし，可溶型PRRがfurin切断部位特異的抗体との交叉性を示すかどうか明らかにする。
作製した切断部位特異的抗体を用いて，細胞内で可溶型PRRが，いつ，どこで作られ，どのように分泌されるかを，CHO/hPRR-10His細胞を用いて解析する。PRRは主に小胞体に局在しており，ゴルジ体で可溶型に変換された後，分泌されると考えられる。申請者のこれまでの実験結果を考え合わせると，全長型PRRの小胞体からゴルジ体への輸送，ならびに切断後の可溶型PRRの細胞内輸送は，何らかの調節を受けていると考えられる。このことを念頭に，以下の実験を進める。①可溶型PRRがどこで作られるかを明らかにするため，切断部位特異的抗体とオルガネラ・マーカーとで細胞を二重染色し，細胞内分布を解析する。②可溶型PRRの生成を経時的に解析する。可溶型PRR生成の経時変化は，切断部位特異的抗体を用いたウェスタンブロット法，ならびに免疫蛍光抗体法で解析する。③可溶型PRRの産生量がどのような条件で変化するか，様々な薬剤で細胞を処理し，その影響を評価する
以上の結果を踏まえて，可溶型PRR産生機構のモデルを提唱する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度に予算計上していた論文校閲・掲載料，ならびに学会発表のための旅費の支出がなかったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
現在，論文作成中であり，校閲・掲載料を支出予定である。また，学会発表を予定しており，旅費を支出予定である。
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