| 研究課題/領域番号 |
26450124
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
有馬 二朗 鳥取大学, 農学部, 准教授 (80393411)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | アミノリシス / D体特異的アミノ酸アミド加水分解酵素 / 副反応 / 立体構造解析 / ペプチド結合形成 |
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| 研究実績の概要 |
MEROPSのfamily S12に分類されるセリンペプチダーゼの中には、加水分解の副反応として高いアミノリシス活性を示す酵素があり、その機能はものづくりや新奇物質／新奇機能の探索研究に応用可能である。我々が保有する放線菌のD体特異的アミド加水分解酵素（DAH）は、family S12に属するアミノリシス活性が高い酵素であり、反応液中にアミン類を10 mM仕込むと、水（約55 M）の1/5,500濃度のアミノ基を認識し、アミノリシスを触媒する。本研究では、アミノリシスの反応機構の解明と機能性物質構築ツールとしての利用可能性の拡大を目的として、DAHの立体構造解析を行った。
DAHは、アミノ酸誘導体とジアミノアルカンを基質として反応を行うと、両化合物の縮合物が得られる。またDAHにジアミノアルカンを添加すると、正四面体結晶が形成される。そこで、得られた結晶を使用してX線結晶構造解析を行った結果、約1.49Åの解像度でDAHの構造が決定された。本酵素の分子表面には大きな空洞があり、その底に活性中心Ser残基が存在していた。また、活性中心の傍には小さな窪みが存在し、構造既知の類似酵素と重ね合わせて解析した結果、窪みは基質ポケットであることが示唆された。
基質ポケットを構成する残基のうち、Gly及びAla以外をAlaに置換し、アミノリシス活性を調べた結果、Ile266及びIle338をAlaに置換すると、野生型DAHと比較してアミノリシスでのアシル受容体特異性の幅が広がり、より大きな分子や疎水性の高い分子もアシル受容体として認識できるようになった。これらの結果は、基質ポケットの形状変化と関係していることは確実であり、ポケットの広さの拡大が、大きい分子や疎水度の高い分子をアシル受容体として認識できるようになる要因となると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画では、放線菌のD体特異的アミド加水分解酵素（DAH）の立体構造解析と、そこから予測される基質認識やアミノリシス反応に大きく関わりのある残基の予測やAla置換による機能解析を初年度（平成26年度）に計画しており、研究実績の概要に示すよう、DAHの立体構造が解明され、そこで見つけられた基質ポケットがアミノリシス反応に関連していることを初年度で明らかにできたことから、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
得られた結果の中で、特に、DAHの基質ポケットに存在する2つのIle残基（Ile266及びIle338）を置換して基質ポケットの形を広げると、大きくアシル受容体の特異性が変化することが示された。これは、DAHが合成できるペプチドのバリエーションが増大したことが示され、本プロジェクトの最終目標である「機能物質探索に寄与できる、より強力な生体触媒の創出」の実現に向け、大きく前進したことになる。まだ、酵素機能学的に未解明な部分の存在し、また合成酵素学として生産に応用するには多くの課題を残すところである。そこで次年度（平成27年度）では、基質ポケットの中でも2つのIle残基（Ile266及びIle338）に焦点を絞り、Ala以外への置換や2重変異酵素作成などを通し、DAHをよりアミノリシス活性に特化した酵素の創生を目指した検討を行う予定である。これら次年度の研究予定も含め、当初に予定していた計画通りである。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの達成度に示した通り、初年度において、放線菌のD体特異的アミド加水分解酵素（DAH）立体構造解析と機能領域及び残基の推定／特定を行った。これらの遂行は、ほぼ当初の計画通りであり、今後の研究についても、申請書に記述した内容／計画に沿って遂行できるものであると考えている。
今後は、DAHの基質特異性拡大とアミノリシス活性増強、そしてこれらの過程で創製された変異DAHを合成の触媒として利用出来るかどうかの評価が大きな課題となる。また、現在、別のプロジェクトにおいて、野生型DAHの酵素反応液ライブラリー（様々な基質の組み合わせからなる酵素反応液群）から、有用物質を探索しようとする研究が行われている。本研究課題では最終的には、別のプロジェクトで構築された有用物質探索に係る技術に乗っ取って、本研究課題を遂行することで構築される変異酵素を利用したライブラリーの作成と、そこから新たな有用／機能物質探索研究まで進める予定である。
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