| 研究課題/領域番号 |
26450140
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| 研究機関 | 大阪府立大学 |
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研究代表者 |
甲斐 建次 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 講師 (40508404)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | クオラムセンシング / AHL合成酵素 / アフィニティービーズ / プルダウン |
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| 研究実績の概要 |
前年度に作製したアフィニティービーズでは、微量のAHL合成酵素をプルダウン精製することが困難であった。その理由として、リガンドとビーズの固定化時に生じるトリアゾール環の立体・電子的障害と、リガンド-リンカー部分の疎水性に基づく凝集に原因があることが推察された。そこで、リンカー部位に改変を加えることを計画した。これら２つの課題を解決する最も良い方法として、ポリエチレン（PEG）スペーサーの導入を行った。リンカー部分に、様々な鎖長のPEGスペーサーを導入し、新しいアフィニティービーズを作製した。合成法はこれまでの方法を踏襲し、最後のリンカー導入時にPEGスペーサー入りリンカーを導入した。PEGが高極性であるため、最終反応の収率が大きく低下してしまったが、改良型アフィニティービーズを充分量作製することができた。PEG導入の改良型ビーズと未導入型ビーズの性能を比較したところ、改良型で飛躍的にAHL合成酵素の収量が増加した。その増加量は10倍ほどであり、微量のAHL合成酵素をプルダウンできることが期待された。さらに、特異性の低下などを詳細に調べた結果、いずれの項目においても改良型では性能の向上が認められた。微量のAHL合成酵素のプルダウン精製に向け、細胞ライセート側の条件最適化についての検討も進め始めた。市販のタンパク抽出試薬では、抽出効率は良いものの、結合を阻害している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アフィニティービーズの改良が進み、微量のAHL合成酵素をプルダウン精製できるようになったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
改良型アフィニティービーズを用いて、様々な細菌よりAHL合成酵素をプルダウンできるかどうかを検討する。また、接合菌内に共生するエンドバクテリアのAHL合成酵素の同定を試みる。
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