ニワトリ卵白リゾチームの反応機構仮説に基づく新規遷移状態アナログの分子設計と展開

2014 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 26450147
• 研究機関: 福島工業高等専門学校
• 研究代表者: 尾形 慎 福島工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (10532666)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: リゾチーム / 遷移状態アナログ / 阻害剤 / キチン / オリゴ糖

研究実績の概要

《１）GN3Lの合成》Phillipsが提唱したHEWL遷移状態のアナログとして、(GlcNAc)4の還元末端GlcNAc残基を2-アセタミド-2,3-ジデオキシジデヒドロ-グルコノ-δ-ラクトン（L）構造に変換したGN3Lの合成を行った。方法は、400 mMホウ酸緩衝液（pH 7.0）に対して終濃度が100 mMとなるように(GlcNAc)4を溶解後、100℃で1時間加熱処理した。結果、生成物として還元末端GlcNAc残基のC2とC3が選択的に脱水されたGN3Dを収率4.4%で得た。さらに、亜臨界条件で反応を行うと触媒なしでも、水溶媒のみでGNnDが合成可能であることを実証した。続いて、GN3Dを蒸留水に溶解後、活性炭触媒を15%（w/v）となるように添加し、60℃で120時間反応を行った。結果、GN3Lへの定量的な構造変換を確認した。
《２）GN3Mの合成》HEWLを触媒素子とした糖転移反応を利用することで、Koshlandが提唱した遷移状態のアナログとしてモラノリン（M）を末端構造に有するキトトリオシルモラノリン（GN3M）の合成を行った。具体的には、(GlcNAc)4とモラノリンのモル比率が1対7、反応液の全基質濃度が2.9%（w/v）となるように調整後、HEWLを添加し50℃で100時間反応を行った。生成物としてGNM、GN2M、GN3Mを収率36.3、5.9、2.7%で得た。
《３）GNnD, GNnL, GNnMの利用》①GNDを基質としてβ-NAHaseの加水分解反応を行った。その結果、GNDから遊離したD構造は直ちにChromogen Iへ構造変換することが明らかとなった。この特徴を利用して、β-NAHaseの反応速度論解析を行うことに成功した。②HEWL以外のfamily GH22リゾチームに対する阻害効果を実証するため、GN3Lと無脊椎動物型のハマグリリゾチームとの結合試験を行った結果、共結晶の構造を1.77Åの分解能で決定した。③GN2Mがコケ由来family GH19キチナーゼの基質結合サブサイトに強く結合することをITC及びNMR法によって明らかにした。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成26年度の研究計画および方法に掲げた、HEWL遷移状態アナログの合成に関しては、Phillipusが提唱した遷移状態のアナログとして(GlcNAc)4の還元末端GlcNAc残基を2-アセタミド-2,3-ジデオキシジデヒドロ-グルコノ-δ-ラクトン（L）構造に変換したGN3Lを、Koshlandが提唱した遷移状態のアナログとして1-デオキシノジリマイシン（モラノリン；M）を末端構造に有するキトトリオシルモラノリン（GN3M）を合成した。また、GN3L、GN3Mともに反応条件の最適化を行い、合成収率をこれまでより向上することに成功した。さらに、HEWLの－4から－2サブサイトへの結合に関与するキチンオリゴ糖鎖長の影響を評価する目的で、GNL、GN2L、GNM、GN2Mも合成し、阻害剤ライブラリーの構築を行った。
また、平成27年度以降の研究計画および方法に掲げた本遷移状態アナログの他酵素への応用にも着手した。その結果、コケ由来のfamily GH22キチナーゼやハマグリ由来のi-type リゾチームにも本阻害剤は作用することが示された。これらの結果より、HEWL遷移状態アナログの設計原理は他酵素にも適用可能であることが示された。この情報をもとに現在さらなる機能設計を進めている。
以上のように全体的には、平成26年度の計画に掲げた内容は十分達成できている。

今後の研究の推進方策

平成27年度の研究計画に従い、平成26年度に合成した各種HEWL遷移状態アナログを用いて、本阻害剤ライブラリーの機能評価およびHEWLの反応機構解析を行う。また、HEWLのみならず、他のfamily GH22リゾチームやfamily GH19キチナーゼに対する阻害効果を評価する。さらに、HEWL遷移状態アナログの設計原理をセルラーゼやアミラーゼなどのエンド型グリコシダーゼに適用することによる新規阻害剤の合成やオリゴ糖誘導体の利用研究を行う。

次年度使用額が生じた理由

平成26年度に予定していた研究が予定通り進行したため、次年度の研究に充てることにした。

次年度使用額の使用計画

平成27年度に予定している遷移状態アナログ解析および機能設計の物品購入費に充てる。

研究成果

• [雑誌論文] The structure of the proteinaceous inhibitor PliI from Aeromonas hydrophila in complex with its target lysozyme. (2015)
  • 著者名/発表者名: Leysen, S., Van Herreweghe, J. M., Yoneda, K., Ogata, M., Usui, T., Araki, T., Michiels, C. W., Strelkov, S. V.
  • 雑誌名: Acta Cryst. 巻: D71 ページ: 344-351
  • DOI: 10.1107/S1399004714025863
  • 査読あり
• [雑誌論文] Non-catalytic dehydration of N,N’-diacetylchitobiose in high-temperature water. (2014)
  • 著者名/発表者名: Osada, M., Kikuta, K., Yoshida, K., Totani, K., Ogata, M., Usui, T.
  • 雑誌名: RSC Adv. 巻: 4 ページ: 33651-33657
  • DOI: 10.1039/C4RA06319H
  • 査読あり
• [雑誌論文] Interaction of di-N-acetylchitobiosyl moranoline with a family GH19 chitinase from the moss, Bryum coronatum. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shinya, S., Urasaki, J., Ohnuma, T., Taira, T., Suzuki, A., Ogata, M., Usui, T., Lampera, O., Juffer, A. H., Fukamizo, T.
  • 雑誌名: Glycobiology 巻: 24 ページ: 945-955
  • DOI: 10.1093/glycob/cwu052
  • 査読あり
• [雑誌論文] リゾチーム遷移状態アナログの設計に基づく反応機構の検証 (2014)
  • 著者名/発表者名: 尾形 慎, 碓氷 泰市, 梅本 尚之, 大沼 貴之, 深溝 慶, 沼田 倫征
  • 雑誌名: 化学と生物 巻: 52 ページ: 819-824
  • 査読あり
• [雑誌論文] リゾチーム遷移状態アナログの合成と反応機構の解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 尾形 慎, 碓氷 泰市, 梅本 尚之, 大沼 貴之, 深溝 慶, 沼田 倫征
  • 雑誌名: 応用糖質科学 巻: 4 ページ: 308-313
  • 査読あり
• [学会発表] リゾチーム遷移状態アナログの設計に基づく反応機構の検証 (2015)
  • 著者名/発表者名: 尾形慎、碓氷泰市、梅本尚之、大沼貴之、深溝慶、沼田倫征
  • 学会等名: 日本農芸化学会シンポジウム
  • 発表場所: 岡山大学（岡山県）
  • 年月日: 2015-03-29
  • 招待講演
• [学会発表] エールリッヒ試薬との呈色反応に基づく糖質加水分解酵素の新規活性測定法 (2014)
  • 著者名/発表者名: 尾形慎、松﨑優香、平良東紀、碓氷泰市
  • 学会等名: 日本応用糖質科学会
  • 発表場所: 朱鷺メッセ（新潟県）
  • 年月日: 2014-09-24
• [学会発表] キチンオリゴ糖誘導体を用いた糖加水分解酵素の新規活性測定法 (2014)
  • 著者名/発表者名: 松﨑優香、平良東紀、碓氷泰市、尾形慎
  • 学会等名: キチン・キトサンシンポジウム
  • 発表場所: 順天堂大学（東京都）
  • 年月日: 2014-08-08
• [備考] 尾形 慎 - 研究者 - researchmap
  • URL: http://researchmap.jp/ogata-m/