| 研究課題/領域番号 |
26450151
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
好田 正 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (20302911)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | アレルギー / 免疫寛容 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、アレルゲン分解物を用いた食品アレルギー予防ワクチンの最適な実施条件の確立を目的としている。
初年度はまずはじめに、ヒトへ応用可能なアレルギー予防ワクチンに使用するため、多様なペプチドを含むアレルゲン分解物を調製した。２年目は予防ワクチンに必要な抗原の摂取量を食品アレルギーモデルマウスを用いて検討した。卵白アルブミン（OVA）を150もしくは200 mg/mLとなるように水に溶解し、OVA特異的T細胞レセプタートランスジェニックマウスに2または3週間自由飲水させた。期間終了後に、脾臓細胞を調製しOVAの存在下で3日間培養した。培養後に細胞の増殖応答、上清中のサイトカイン産生量を測定した。その結果、150 mg/mLの抗原を3週間飲水させることで強い経口免疫寛容が誘導されることが明らかとなった。
次に、上記で得られた抗原の投与量に基づき、抗原分解物の調製を試みたが、従来の方法では収率が低く、必要量の抗原を得ることが困難であることが明らかとなった。そこで、より高収率な分解方法の確立を目指した。従来の方法で収率の低下をもたらしている大きな要因が、酸処理中に凝集物が生じ、最終段階で取り除かれてしまうことであった。そのため、従来は抗原を酸に直接溶解していた方法を改良し、まず抗原を純水に溶解した後に、酸を加える方法にした。また、処理時の抗原濃度も従来の10分の1に希釈した。その結果、凝集物はほとんど生じなくなり、収率の大幅な向上に成功した。一方で、抗原の濃度を低下させたことにより反応時の液量が増え、反応停止のための中和によって生じる塩の量が無視できない状態となった。そのため、これまでは行っていなかった脱塩処理に供してから、ワクチン抗原として用いることとし、現在分解物からカラムにより塩を除去している。脱塩が終了し次第、食品アレルギーモデルマウスに投与し、ワクチン効果を実証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、食品アレルギーモデルマウスに強い経口免疫寛容を誘導するために必要な抗原量を決定することができた。しかしながら、その結果を基にワクチン効果の実証に必要な抗原量を計算したところ、従来の調製方法ではその量の分解抗原を得ることが困難であることが明らかとなった。そこで、抗原の酸分解方法を再検討した。分解時における懸濁液の調製法、および懸濁液の濃度を変更したところ、大幅な収率の向上を達成することに成功した。研究の遂行において、抗原の調製法を改良するために分解アレルゲンの調製方法を計画と変更し、ワクチン効果の実証実験を次年度に持ち越したため、当初の計画よりは遅延している部分もあるが、本研究で確立した効率的に酸分解抗原を調製する方法は、今後の実験の実施においては極めて有益な成果であり、次年度に実施する実験の実施期間を短縮することにつながるため、最終的には当初の予定通りの研究成果を得ることができると考えている。また、これまでの方法では未分解のまま廃棄されていた凝集物がなくなったため、実用化に向けてはむしろ大きな前進であったと考えている。
本研究では、ワクチンに用いる抗原の量を定量的に把握する必要があるため分解抗原の調製の際に生じた塩を除去してから実験に供することとしたが、生じている塩は塩化ナトリウムであるため、実用化段階では除去の必要はないと考えている。すなわち、新たに確立した抗原の分解方法は、以前の方法と比較して実用化に向けた障害はないと判断した。
また、当初の計画に含まれていた食品アレルギー予防ワクチンの作用メカニズムの解析は、最終年度に実施することとなったが、分解抗原の効率的な調製法が確立できたため、次年度に実施しても予定している結果を得ることは十分に可能であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度に確立した、分解アレルゲンの効率的な調製法で調製した分解アレルゲンをワクチンとして用いて、実際に食品アレルギーを予防できることを実証する。この際、本年度に決定した抗原の最適な投与量と投与期間に基づき、食品アレルギー予防ワクチンの条件を設定する。さらに、既にアレルギーを発症したマウスに対して同様な処理をすることで、予防だけでなく治療効果も検討し、両者における有効性の違いを明らかにする。現在、臨床の現場で実施されている減感作療法は治療のみに限定されているが、治療よりも本研究のテーマである予防的に用いた方が効果的にアレルギーを抑制できることを実証する。
加えて、本年度までに実施できなかった分解アレルゲンによる食品アレルギーの予防メカニズムを解析する。その際、分解アレルゲンの摂取による抑制性T細胞の誘導に着目する。
これらの結果をより一般化するために、モデルアレルゲンとしてOVAを、食品アレルギーモデルマウスとしてDO11.10を用いて得られた成果を、他の食品アレルゲンやマウス系統に応用するための実験系を確立する。すなわち、他の食品アレルギーモデルマウスの確立を試みる。食品アレルギーモデルマウスは、本実験で用いているOVAに加え大豆や乳由来のアレルゲンをBALB/c、DBA/1、NC/Ngaマウス等の皮膚に塗布した後に、アレルゲンを経口摂取させることで誘導することを試みる。これによって誘導が認められない場合は、事前にアジュバントとともにアレルゲンを免疫したマウスよりT細胞を分離し、同系未感作マウスに移入した後にアレルゲンを摂取させることによる食品アレルギーの誘導を試みる。これらの中から食品アレルギーを発症することが示された実験系を用いて、OVAとDO11.10マウスで実施した実験と同様にして酸分解アレルゲンによる食品アレルギー予防ワクチン効果を実証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
酸分解物の調製方法を再検討したことにより、研究の実施状況において計画に対し若干の変更の必要性が生じたため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本年度予定していた研究計画の一部を次年度に実施するための経費として使用する。
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