| 研究課題/領域番号 |
26450165
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
高橋 恭子 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (70366574)
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| 研究分担者 |
細野 朗 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (70328706)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 腸管上皮細胞 / 腸内細菌 |
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| 研究実績の概要 |
腸管には生体で最大の免疫系が存在するにもかかわらず、免疫学的に異物である莫大な数の腸内細菌が排除されてしまうことなく共生している。本研究では、腸内細菌からの刺激を常に最前線で受け取る腸管上皮細胞に着目し、共生のエピジェネティックな分子機構を解析した。
昨年度から継続の解析により、腸管上皮細胞において腸内細菌によりDNAメチル化が誘導される遺伝子集団を特定した。メチル化誘導過程の腸管上皮細胞を用いたプルダウンアッセイにより、これらの遺伝子集団へのメチル化酵素のリクルート因子を同定するために、ヒト腸管上皮細胞株HCT 116を用いて脱メチル化後に再メチル化を誘導する条件を決定した。今後、この条件を用い、腸内細菌刺激の存在下および非存在下でプルダウンアッセイを行う。
一方、腸管上皮細胞に発現するマイクロRNA(miRNA)のうち、腸内細菌により発現が誘導されることが明らかになったmiR-21-5pについて、発現誘導機構の解析を行った。その結果、複数の菌体成分リガンドによりMyD88依存的に発現が誘導される傾向が示された。インヒビター導入試験により昨年度このmiRNAが上皮透過性の制御に関わることを明らかにしたが、さらに、菌体刺激に対する炎症性ケモカインIL-8の産生応答への影響を調べたところ、IL-8産生応答は変化しないことが明らかになった。次に、このmiRNAのターゲットを同定するために、miR-21-5pあるいはコントロールのアンチセンスLNAインヒビターを導入した腸管上皮細胞株の細胞抽出物を2次元電気泳動に供し、発現量に顕著な差がある複数のスポットにつきMS/MS解析を行い、候補分子を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
腸内細菌によるDNAメチル化制御に関わる分子の同定のための条件検討を行い、条件を決定することができた。また、腸内細菌により発現が誘導されるmiRNAの標的候補分子を同定した。腸内細菌によるDNAメチル化制御に関わる分子の同定については一部来年度に継続して持ち越しとなったが、おおむね計画に沿って研究を遂行することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成27年度に決定した条件を用い、メチル化誘導過程の腸管上皮細胞を用いたプルダウンアッセイにより、腸内細菌によりDNAメチル化が誘導される遺伝子集団へのメチル化酵素のリクルート因子の同定を試みる。同定された分子および平成27年度に特定された腸内細菌依存的なmiRNAのターゲット候補分子について、腸管における機能や発現パターンを解析し、共生の成立・破綻、腸内共生系の恒常性維持における役割を明らかにする。さらに、これらの分子の発現や機能が腸内細菌によりどのように制御されるか、腸内細菌のうちどの菌種が高い制御活性を有するか解析する。腸内共生系の改善効果を有する食品成分の評価系を構築するために、これらの分子のうちで機能が明確になった分子について、食品因子による腸管内生態系の制御のためのターゲットとしての有用性を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
腸内細菌によるDNAメチル化制御に関わる分子の同定について、実験条件の検討に予想よりも時間がかかり、今年度の計画の一部が来年度に継続して持ち越しとなったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上記実験に使用する分子生物学・生化学実験試薬と細胞培養フラスコやチューブ等のディスポーザブル器具の購入代として使用する。
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