| 研究課題/領域番号 |
26450185
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| 研究機関 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 |
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研究代表者 |
高畠 令王奈 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門・食品分析研究領域, 上級研究員 (20463466)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 定量分析 / DNA / PCR / 分子 |
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| 研究実績の概要 |
PCR技術は、様々な研究分野から検査業務に至るまで幅広く利用されている。定性的なPCR分析では、僅か１分子のDNAも検出可能であると考えられているが、その一方で、DNA定量分析の技術的限界に関しては、これまで全く検証されてこなかった。これは、そのような検証が可能な、ごく少数のDNA分子を含む標準試料が存在していないことに起因する。本研究では、そのようなごく少数の規定数N個のDNA分子を含む標準試料DNAを開発し、さらに、既存のDNA定量技術の限界を検証する。具体的には、標的配列をN個含む標準DNA-Nを作製する場合には、PCR標的配列をN個直列につなぎ、さらに、それらの標的配列の間に制限酵素の認識配列を配置した状態でプラスミドDNAに導入する。この標準DNA-Nを含む限界希釈溶液（試料溶液中に標準DNAが1個ないしは0個しか入っていない状態）を、分析直前に制限酵素処理することにより、分子数が任意のN個からなる標準DNAの調製が可能となる。本研究では、遺伝子組換え（GM）検知での適用を主要目的としていることから、GM検知に用いられているDNA配列を中心に設計を行っており、今年度は、我が国のGMダイズ検知における標準分析法で利用されているダイズ内在性配列Lectin1 (Le1)を用いた。ただし、昨年度の検討から、単純に同じ配列を繰り返すと、何らかの立体障害等が発生するのか標準DNAの構築がうまくいかなくなったことから、繰り返し配列の周辺に無関係なジャンクション配列を導入させた。ジャンクション配列には、A、T、G、Cのバランスの取れたランダム配列を採用した。これにより、Le1配列が16個導入された標準DNAの構築に成功した。さらに、Le1以外の組換え配列に関しても、標準DNAの設計を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は標準DNAの構築を行う予定であったが、ほぼ予定通り進んでいる。具体的には、Le1配列を、それぞれ1個、2個、4個、8個、16個含む標準DNAを構築した。構築の際には、昨年度、本研究目的に適した制限酵素の選抜を行った際に比較的良好な結果を示した3種類の制限酵素KpnI、PstIおよび SphIの認識配列を、各Le1配列の間に配置した。また、標準DNAの構築にあたっては、昨年度までは、対象配列を制限酵素等によって切りだしてから平滑末端化を行い、DNAライゲーション反応によって既にある配列の隣につなげて伸長を行っていたが、この方法は非効率的であり、また、繰り返し配列が8個、16個と長くなるにつれてライゲーション効率が著しく悪くなるといった問題がみられた。今年度は、この点を改良すべく、ゲノム編集等に利用されるTALENタンパク質の人工遺伝子構築に利用されているゴールデンゲート法を導入し、一度に4個のLe1配列をつなげる方法を開発した。さらに、標準DNAの評価に関しては、Le1だけでは頑健性に問題があると考えられたので、Le1以外に、GMトウモロコシ検知における標準分析法で利用されているトウモロコシ内在性配列Starch synthase IIb （SSIIb）遺伝子および多くのGM作物に導入されているカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（P35S）に関しても、PCRの標的配列をタンデムに複数個つなげた標準DNAを構築すべく、設計等を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
標準DNAに関しては、Le1を1個、2個、4個、8個、16個つないだものまで構築したので、引き続き32個つながったものまで構築する。これは、段階希釈によって調製されたDNAの場合も、20個程度まではリアルタイムPCRによって定量が可能であると論文等で報告されているからである。さらに、頑健性の面から、SSIIbおよびP35Sに関しても、Le1と同様にPCRの標的配列を複数個つないだ標準DNAを構築する。
複数の標準DNAの構築が終了した後は、それぞれの標準DNAを、キャリアDNAを含む溶液で段階希釈し、限界希釈溶液を調製する。このような、任意の個数のPCR標的配列を含む標準DNA群を用いて、様々なDNA定量法あるいは、定量装置の定量限界等を検証する。リアルタイムPCRを用いた場合には、仮に定量が可能であれば、異なる分子数のLe1を含む標準DNA間では、Cq値間で統計学的な有意差が生じるものと予想される。したがって、標準DNA中のPCR標的配列の個数を段階的に減らしていき、何分子のDNAまでCq値に有意差がみられるか検証する。また、デジタルPCR解析に関しても、DNAの絶対定量が可能であるならば、PCR標的配列がN個ある場合には、N個のポジティブシグナルが得られるはずである。こちらも同様に、実際にどの程度の個数まで、想定通りの結果が得られるか繰り返し検証し、一定の割合で正確な値が得られる場合には、その頻度を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
標準DNA構築に関しては、当初は、標的配列をすべて人工遺伝子合成で外注する予定であったが、一部、PCRによってより安価な構築を行った。しかしながら、次年度以降は、複数の標的に対して標準DNAを構築する予定であることから、人工合成の外注は避けられないと予想される。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額577,418円は、次年度に請求する研究費と合わせて、交付申請時の計画どおり、物品費および旅費等、研究遂行のために使用する。とくに、次年度以降は、さらに複数の標準DNAを構築することに加えて、構築した標準DNAを用いた検証実験を予定していることから、リアルタイムPCRやデジタルPCR等の消耗品が大量に必要になると予想される。
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