| 研究課題/領域番号 |
26450236
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
板倉 修司 近畿大学, 農学部, 教授 (60257988)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | RNA干渉 / 二本鎖RNA / 昆虫制御剤 |
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| 研究実績の概要 |
シロアリのヘキサメリンから得られた長鎖部分配列DNA(583bp)あるいは短鎖部分配列DNA(19bp)を、マルチクローニングサイトの上流と下流にT7プロモーター配列をもつL4440プラスミドとライゲーションした。
得られたプラスミドに変異が起こらないように、プラスミドの組み換えを起こさない(RecA-)宿主大腸菌DH5αを用いて形質転換体を作成した。
まず、上述の長鎖部分配列あるいは短鎖部分配列とライゲーションしたL4440プラスミドで、宿主大腸菌BL21(DE3)の形質転換を行った。これらの形質転換大腸菌の培養液に、IPTG（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を添加し、標的配列センス鎖RNAとアンチセンス鎖RNAを同時に誘導することで、形質転換大腸菌細胞内での二本鎖RNAの調製を試みた。この際、種々のRNase阻害剤を培養液に添加したが、二本鎖RNAの大量合成には至らなかった。
次に、二本鎖RNA分解酵素であるRNaseIIIを欠損した大腸菌HT115(DE3)を宿主とした形質転換を行った。具体的には、HT115(DE3)大腸菌のコンピテントセルを作成し、上述したヘキサメリン長鎖部分配列あるいは短鎖部分配列とライゲーションしたL4440プラスミドによる形質転換を行った。形質転換体が適切に作成されているかを検証するため、PCRによるインサートチェックならびにシークエンサーによる配列の確認に取り組んでいるところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では、二本鎖RNAを大量に細胞内で合成させた大腸菌を滅菌した後に、シロアリに投与しシロアリの体内での標的mRNAの存在量を定量している予定であった。現状では、二本鎖RNAの大腸菌内での大量培養に予想以上に時間がかかっており、二本鎖RNAを発現した大腸菌の投与に至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸菌内に生成した二本鎖RNAを分解する酵素であるRNaseIIIの欠損株である大腸菌HT115(DE3)を用いた形質転換体の作成を継続する。二本鎖RNAを細胞内で合成する大腸菌の作成に成功した後は、二酸化塩素などによる大腸菌の死滅化を行う。死滅を確認した大腸菌をシロアリに投与し、シロアリ体内でのmRNA発現量の変化を検討する。
また、一昨年に実施したmicroRNA分析の結果の解析が完了し、イエシロアリとヤマトシロアリに存在する100種類以上microRNA候補配列を見出した。今後はシロアリの制御に有効なmicroRNA配列（例えば、クチクラ合成の制御に関与するmicroRNAや卵巣・精巣の発達に関与するmicroRNAなど）を標的とし、microRNAあるいはmicroRNAインヒビターのシロアリへの注入を行い、microRNAのシロアリへの影響を検討する。
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