| 研究課題/領域番号 |
26450237
|
|---|
| 研究機関 | 近畿大学 |
|---|
研究代表者 |
白坂 憲章 近畿大学, 農学部, 教授 (20268452)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | フォスファチジルセリン脱炭酸酵素 / グルタミン酸脱炭酸酵素 / シイタケ |
|---|
| 研究実績の概要 |
研究開始時、すでに精製が終了していたマイタケ（Grifola frondosa）グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）のアミノ酸配列情報から設計したプライマーを用いたPCRクローニングを試みたが、増幅が見られなかった。そこで、すでに開始していたシイタケ（Lentinula edodes）のGABA生成酵素の精製を進めたところ、シイタケからはL-グルタミン酸以外にもL-アスパラギン酸などの炭素数の異なるα-アミノ酸にも作用し、L-グルタミン酸にのみ作用するGADとは異なる酵素が単離された。精製酵素のアミノ酸配列分析から得られた情報を森林総合研究所が提供するシイタケ全ゲノム配列データベースと照らし合わせることにより酵素の同定を試みたところ、フォスファチジルセリン（PS）脱炭酸酵素（PSD）と100%一致した。PSDは生物の細胞膜の重要な構成成分であるフォスファチジルエタノールアミン（PE）をPSから生成する、リン脂質の生合成系における重要な酵素である。しかし、これまでにPSDがPS以外にアミノ酸などの脱炭酸を触媒するという報告はなく、現在、シイタケ由来の酵素を用いて基質特異性の検討を含めた性質について検討を行っている。また、本酵素のデータベース上のアミノ酸配列はBLAST検索によっても相同性70%を越えるタンパク質はヒットしないものの、すでに単離しているマイタケGADのN末端アミノ酸配列情報と高い一致が見られたため、マイタケの酵素もGADではなく、PSDである可能性も考えられる。現在、酵母によるシイタケ由来PSD遺伝子の異種遺伝子発現を試みるとともに、マイタケの酵素についてもシイタケPSDの配列情報を参考にプライマーを設計しなおしクローニングを試みている。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでにほとんど情報のなかった食用きのこのGABA生成にかかわる酵素としてマイタケ、エノキタケ以外にシイタケ由来の酵素を単離し、精製酵素のアミノ酸配列情報より、本酵素がグルタミン酸脱炭酸酵素（GAD）ではなくフォスファチジルセリン脱炭酸酵素（PSD）である可能性を示した。この結果は研究開始当初には予想されなかった結果であるが、PSDは生物の細胞に広く分布し、細胞膜成分であるフォスファチジルエタノールアミン生合成の主たる生合成経路上に位置する酵素であることから、きのこでは細胞増殖に伴いGABAが蓄積する可能性が示唆され、きのこにおけるGABA蓄積の新たな知見が得られた。またデータベースの情報をもとにPCR法を用いてcDNAクローニングを行い、当該遺伝子のクローニングまで完了しており、現在、本遺伝子の発現解析およびノックダウン株の作成を行うことにより、シイタケのGABA生成への本酵素の関与を明らかにするための基盤が整った。
|
| 今後の研究の推進方策 |
26年度の研究において、シイタケのGABA生成にGADではなくPSDが関与している可能性が強く示唆されたが、これまでにPSDがGABAの生成に関与しているという報告はなく、本酵素がシイタケのGABA生成における鍵酵素であるかは現在のところ明らかではない。そこで、現在クローニングまで終了している本酵素遺伝子を酵母などで発現させることによりグルタミン酸の脱炭酸活性があるかを確認するとともに本遺伝子のノックダウン株を作成し、GABA蓄積におよぼす影響について明らかにする。また、本酵素のアミノ酸配列解析の結果、以前の解析で相同性を示す配列がBLAST検索にてヒットしなかったマイタケ由来のGADについてもアミノ酸配列の相同性が認められたため、本遺伝子内のPSDモチーフを参考にあらたにプライマーセットを設計し、マイタケ酵素遺伝子のクローニングについても進めていく。
一方、シイタケにおけるGABA生成に関与する酵素がGADではなくPSDである可能性が示されたことより、GABAシャント経路そのものが存在するかをGABA-Tの検出だけではなく、データベース上での関連遺伝子の検索とクローン化および発現解析を進めていく。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度、実験計画で支出するための経費として全額使用する予定であったが、発注する物品を、DNAカスタム合成（プライマー）から、ファスマックDNAシーケンスサービスに急遽変更したため、その差額として（1,838円）の次年度使用額が生じた。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額である（1,838円）は、DNAカスタム合成（プライマー）に使用する予定である。
|
