| 研究課題/領域番号 |
26450249
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
豊田 健介 日本歯科大学, 生命歯学部, その他 (40585874)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 海洋ウイルス / 珪藻 / ELISA法 / リアルタイムRT-PCR法 / marine virus / diatom virus / phycology |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は試料ウイルスのゲノム性状解析および塩基配列の解析、リアルタイムRT-PCR定量法の開発を行った。引き続き、より高感度な自然海水からのウイルス検出定量法を開発することを目的に、下記の2つの実験を主軸に研究を行った。
1. リアルタイムRT-PCR法による検出定量法の精査
2. ポリクローナル抗体によるELISA法による検出定量法の開発
リアルタイムRT-PCR法の精査については、天然海水中に対象となるウイルスが確認されなかったため、自然海水に一定の濃度を培養ウイルス懸濁液を混合することによって試料とし、各段階の操作やプライマー濃度の調整等を行った。結果、昨年度より、2-3倍の検出定量の精度が得られるようになった。
ELISA法の開発では、まず、昨年度に解析されたウイルス (+センス1本鎖RNA) 全長塩基配列より、カプシドタンパク合成遺伝子配列約1,000アミノ塩基長を特定した。この配列より、本実験試料となるウイルスカプシドタンパクに特異性が高いと判断される配列を探索し、ポリクローナル抗体を作成した。本抗体を用い、ELISA法（直接吸着法）によるKT12RNAVの検出定量を試みた。わずかに、ネガティブ試料のバックが確認されたが、溶媒、抗体、ペプチド、各試薬濃度の精査を行ったことにより、昨年度に開発されたリアルタイムRT-PCR法よりも高いウイルス検出感度を示した。また、0.2μmフィルターによりろ過された自然海水と試料ウイルスとの混合液においても同様な結果が得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
研究計画に基づいたウイルスの定量法の開発は概ね順調に行われた。
定点採水を行っている海水からは、従来の限界希釈法による検出定量法も含め、1年を通して標的ウイルスの検出はされなかったため、本実験は、自然海水に実験室内で培養したウイルス株を混合することにより、各実験を行った。
ウイルスリアルタイムRT-PCRについて、各試薬の濃度の他に、試料となるウイルスのろ過および懸濁法により定量値が異なることが確認された。使用するフィルター、サンプルプレートの特性を把握し、様々な精査を行った結果、昨年度より、疑似サンプルを用いた実験では、2-3倍の好感度の検出定量を行うことが可能となった。
ELISA法については、予備実験を行った際に、最も安定的にウイルスが検出された直説法を用いて精査を行った。予備実験では、ネガティブコントロールの系でも定量反応が確認されたが、溶媒の種類、pHおよび抗体ペプチドの濃度を調整することにより、超高感度の検出定量が可能となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度においても、研究計画通り実験を行う。
今年度は、これまで表層水を採水を行っていたが、昨年度に標的ウイルスが確認されなかったことから、採泥を含めて採集し、試料を増やして自然海水中のウイルス検出を試みる。自然海水からの宿主およびウイルスの検出定量に関して、前年度に開発・精査されたリアルタイムRT-PCRおよびELISA法を自然海水へ適応させ、実際にホスト・ウイルス両生態調査の検証を行う。また、ELISA法については、サンドイッチ法による検出定量を試み、また、より特異性の高いモノクローナル抗体を作成し、さらに安定的であり高感度である手法の開発を行う。
従来行われてきた限界希釈法による検出定量に加え、リアルタイムRT-PCR法、そして、ELISA法（競合法・サンドイッチ法）各々の手法による検出定量値の相違より、最も安定的に自然海水生態調査を行える手法を検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
想定していた試薬および培養消耗品について、期間限定のキャンペーン価格により、計画よりも安価で購入・依頼を行うことが可能であったため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
本研究計画における開発では、様々な設定の条件により検出定量法の検証を行う必要がある。前年度の繰越金については、この条件設定を想定よりも多く行うことに使用し、より正確な安定した手法を開発するのに用いる予定である。
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