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嫌気かつ硝酸塩存在下で培養したPseudomonas sp. MT-1菌体を破砕し、超遠心分離によって得られた可溶性画分から、イオン交換クロマトフラフィー、硫安分画。ゲル濾過などによってシトクロムcd1型亜硝酸塩還元酵素の精製を試みた。しかし本タンパク質は不安定で、精製過程で明らかに可視吸収スペクトルの変異が起こり、変性してしまった。グリセロールのような保護剤の使用、プロテアーゼ阻害剤の使用によっても状況は改善されなかった。
また上記の実験の中で、可能性画分からc型シトクロムが精製された。N末端のアミノ酸配列を解析し、解析済みであるゲノム情報と照合することにより、このc型シトクロムは、亜硝酸塩還元酵素関連のタンパク質をコードするnir遺伝子クラスター中のnirM遺伝子産物（NirM）であることが明らかとなった。
還元型NirMは、嫌気かつ硝酸塩存在下で培養したPseudomonas sp. MT-1菌体から得られた可溶性画分によって酵素存在下で急速に酸化された。可溶性画分には亜硝酸塩還元酵素以外にはc型シトクロムから酸素へ電子を伝達する酵素は存在しないと考えられるので、NirMが亜硝酸塩還元酵素への生理的電子供与体であることが示された。一般的にはアズリンと呼ばれる銅タンパク質も亜硝酸塩還元酵素への電子供与体となることが知られているが、本細菌のゲノム中にはアズリン相同タンパク質をコードする遺伝子は見いだされなった。したがってNirMが主要な電子供与体であることが示唆された。
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