| 研究課題/領域番号 |
26450401
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
長野 功 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (40283296)
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| 研究分担者 |
前川 洋一 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10294670)
鎌足 雄司 岐阜大学, 生命科学総合研究支援センター, 助教 (70342772)
呉 志良 岐阜大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (90313874)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 旋毛虫 / 即時型アレルギー / 免疫抑制 / 分泌タンパク質 / 高次構造解析 / サイトカイン / 組換えタンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
旋毛虫感染では、旋毛虫分泌タンパク刺激に対する脾細胞のIL-4の産生が増加し、Th2反応が優位になる。また、旋毛虫感染は、M1マクロファージを抑制し、M2マクロファージを活性化する。一方、T細胞に発現するPD-1は、マクロファージに発現するリガンドであるPD-L1あるいはPD-L2と相互作用することによりT細胞の活性化が抑制されることが明らかになっている。旋毛虫感染による優位なTh2反応は、抗PD-1および抗PD-L2抗体の投与によって抑制され、またM1マクロファージの抑制効果は抗PD-1および抗PD-L2抗体の投与によって減弱した。旋毛虫感染ではマクロファージのPD-L1およびPD-L2の発現が増加しており、感染がPD-1シグナル経路におけるM1からM2への変化およびM2への分化を促進させているものと考えられた。
一方、マクロファージ細胞株であるTHP-1およびU937細胞を用い、旋毛虫分泌53kDaタンパク質(Tp53)を投与した場合のIL-8産生量を観察したが、明らかな変化は認められなかった。また、マウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7を用い、Tp53のNF-κBの転写活性に対する影響を検討した。その結果、Tp53はLPS刺激によるRAW264.7のNF-κB転写活性を低下させた、また、Tp53投与はTLR1, TLR2およびTLR4の活性を抑制した。
また、Tp53の構造生物学的解析ではTp53を低分子化して大腸菌で発現させて結晶化を試みたが、この部位の高次構造が不安定であり、結晶化解析は困難であった。一方、Tp53の全長タンパク質について、結晶化スクリーニングを行ったところ、200程の結晶化条件から10程度の条件まで絞り込むことができた。
即時型アレルギー反応に対する免疫抑制効果の解析ではスギ花粉抗原を主に用いた実験を行うが、今年度においては花粉の主要なアレルゲンであるCryj1およびCryj2の組換えタンパク質を大腸菌だけでなく小麦胚芽無細胞系でも発現させた。次年度に実験に用いる予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
構造生物学的解析ではTp53を低分子化して大腸菌で発現させて結晶化を試みたが、この部分の高次構造が不安定であり、また大腸菌での発現量が極めて少量であるため、結晶化解析は困難であることが明らかになった。、Tp53の全長をコードするタンパク質について、結晶化スクリーニングを行ったところ、200程の結晶化条件から10程度の条件まで絞り込むことができた。以上のように構造生物学的解析においては当初の予定から遅れているが、免疫学的解析ではPD-1シグナル経路における免疫抑制機構についての検討およびNF-κBの転写活性に対する53kDaタンパク質の影響解析は予定通りに行うことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成28年度は最終年度である。平成27年度で大腸菌だけでなく小麦胚芽無細胞系において作成した花粉の主要なアレルゲンであるCryj1およびCryj2の組換えタンパク質を用い、旋毛虫感染またはTp53投与におけるスギ花粉症の抑制効果を観察する。すなわち、マウスに花粉抗原感作を行い、くしゃみ等の異常行動の観察、および気道・肺の組織学的検査を行う。また、感作および感染脾細胞の花粉抗原刺激によるTh1型（IL-2, IFN-γ）、Th2型（IL-4, IL-5, IL-10、IL-13）、およびTh17型（IL-17A）の各サイトカインの量を定量する。また、マクロファージが分泌するIL-6等の各サイトカインの量を定量する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定であったフリーザー（バイオメディカルフリーザー・パナソニック・MDF-437(1×＠370)）は今年度においては現有の物品で対応が可能であった。また、タンパク質の発現・精製用試薬・器具、免疫機能アッセイ用試薬・器具についても現有の試薬・器具についても購入額を抑えることができた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
免疫学的解析に必要な消耗品経費は、実験動物（マウス）購入費および飼育費、小麦胚芽無細胞系組換えタンパク質発現システム、タンパク質精製用試薬（濃縮用フィルター、アフィニティークロマトグラフィー用試薬・器具）、組織培養用試薬・器具、免疫グロブリン・サイトカインアッセイ用試薬・器具、およびフローサイトメトリー用試薬の購入費である。構造生物学的解析に必要な消耗品経費は、大腸菌による組換えタンパク質の発現・精製用試薬・器具の購入費である。また、Ｘ線結晶構造解析実験用として、結晶化スクリーニング用プレート等が必要である。また、旅費として、成果発表の学会旅費が必要である。
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