| 研究課題/領域番号 |
26450404
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| 研究機関 | 鳥取大学 |
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研究代表者 |
山口 剛士 鳥取大学, 農学部, 教授 (70210367)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ワクモ / ニワトリ / 薬剤 / ワクチン / 制御 / 外部寄生虫 |
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| 研究実績の概要 |
ワクモは主に鳥類に寄生する吸血性の外部寄生虫で、養鶏産業では吸血による生産性への影響が問題になっている。特に近年、ワクモ制御に広く使用されている薬剤に抵抗性の集団が出現し、被害は拡大傾向にある。本研究では、ワクモの効果的制御法を新たに確立するため、多様な薬剤に感受性あるいは抵抗性のワクモを全国の養鶏場から採取し、ワクモの薬剤耐性機構解明とワクチン候補分子の探索を実施している。まず、ワクモ制御のため国内で広く用いられているピレスロイド剤の標的分子であるナトリウムチャネルおよび有機リン剤やカーバメイト剤の標的であるコリンエステラーゼの各遺伝子に着目し、そのクローニングを試みた。ナトリウムチャネル遺伝子については、これまでに遺伝子全領域を２分割した状態でそれぞれクローニングを完了した。コリンエステラーゼ遺伝子は、コード領域の一部約1kbの塩基配列を明らかにした。これら遺伝子の塩基配列解明は、各薬剤に対する感受性および抵抗性決定の分子機構解明に不可欠な情報であり、各薬剤への感受性を決定する責任領域の解明や薬剤感受性の遺伝子診断構築のための基礎となる。次にワクモに対するワクチン候補分子探索のため、他のダニ類で様々な生理活性が報告されているセリンプロテアーゼに着目し、ワクモからの検出・精製を試みた。これまでに、ワクモが各世代で異なるプロテアーゼを発現している可能性を示すと共に、成ダニからプロテアーゼの精製を試み、プロテアーゼ活性を示す複数の分子を得た。今後、得られたプロテアーゼ活性を示す分子の性状を明らかにし、ワクチンとしての可能性を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ワクモのプロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）遺伝子をモデルとして、リアルタイムPCR法による発現定量法を確立した。ワクモでの効率的なRNA干渉法を確立するため、マイクロインジェクション法、浸漬法およびエレクトロポレーションによるPDI遺伝子配列のニ本鎖RNAを作出、RNA干渉を試みた。マイクロインジェクション法では実施の際に生存率が比較的高いインジェクション部位を明らかにしたが、インジェクションに時間を要することや時間経過と共に死亡個体が増加し、RNA干渉による標的遺伝子の発現減少の確認には至っていない。本研究の基盤となる次世代シーケンサーを用いた網羅的遺伝子発現解析については、卵、幼ダニ、第１若ダニ、第２若ダニ、成ダニ♀および成ダニ♂から解析に用いるRNA調整を行った。この解析にはゲノムDNAの混入が無い高品質なRNAが必要不可欠だが、残念ながら年度内には解析に供試可能な品質のRNAを得ることができなかった。このため本研究の基盤となる網羅的遺伝子発現解析の実施に至らなかった。そこで、上記解析に依存しない方法で当初目的とした薬剤耐性機構解明のためのコリンエステラーゼ遺伝子およびCYP450遺伝子の探索の他、ワクチン候補となるプロテアーゼ群の探索に着手した。これまでに、コリンエステラーゼ遺伝子の一部配列を明らかにすると共に、ワクモ成ダニからプロテアーゼを検出し、その一部について粗精製を終えたが、生成物から遺伝子へのアプローチは時間を要するため、高品質なRNA調整についてさらに検討を進める予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析は、本研究の推進には必要不可欠である。昨年度は、残念ながら解析に供試可能な高品質のRNAを得ることができなかった。推奨される複数の異なる方法でRNA調整を試みたがいずれの方法でも解析に供試可能な品質のRNAの調整には至らなかった。これまでの実験成績から、特にRNAの調整過程で用いるDNA分解酵素の品質が最終的なRNAの品質と収量に最も大きく影響することが推察され、今後はRNAに対する影響の無いより信頼性の高いDNA分解酵素を用いRNAを調整すると共に、これまでより多くのワクモ個体からのRNA調整を試みる予定である。ワクモでのRNA干渉法確立については、マイクロインジェクション法では時間を要することや死亡率が高いことから、より簡便な方法について検討を行う予定である。次世代シーケンサーによる解析が計画通りに進展しなかったことから、網羅的遺伝子解析で得られたデータを基に進める計画だった薬剤耐性機構解明のためのコリンエステラーゼ遺伝子およびCYP450遺伝子の探索については、縮重プライマーを用いたPCRによる探索を実施している。コリンエステラーゼについては、一部塩基配列が明らかになったため、遺伝子全領域の塩基配列決定を進める予定である。同様にワクチン候補となるプロテアーゼ群遺伝子の探索については、ワクモ成ダニからのプロテアーゼの検出・精製を試み、一部についてプロテアーゼ活性のある分子群の粗精製を確認した。今後は、次世代シーケンサーによる遺伝子解析と平行し、これら分子の単離とアミノ酸配列に決定を試み、得られた情報から研究を推進する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
初年度は次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析（de novoトランスクリプトーム解析）の実施を計画し、初年度予算の大部分をここに充て交付申請を行った。しかし、網羅的遺伝子発現解析に使用可能な品質のトータルRNAを年度内にどうしても得ることができず、実施を断念し予算を次年度に繰り越した。DNAを含まない高品質なRNAの調整については、推奨される複数の方法で精製を試みたが残念ながら得ることができなかった。今年度は、より高品質なDNase等を用い、DNAの混入の無い高品質なRNAを充分量調整し、当初予定していた通り網羅的遺伝子発現解析を実施する予定である。
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| 次年度使用額の使用計画 |
当初予定通り、次世代シーケンサーによる網羅的遺伝子発現解析に使用する。
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