| 研究課題/領域番号 |
26450414
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| 研究機関 | 日本獣医生命科学大学 |
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研究代表者 |
鈴木 浩悦 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50277662)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | mTOR / astrin / 腎臓 / 器官発生 / 慢性腎臓病 |
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| 研究実績の概要 |
微小管結合蛋白質のAstrinは分裂期のHeLa細胞で紡錘糸や中心体に局在し、有糸分裂の進行に必須なだけではなく、間期ではmTORC1の活性化に必要なRaptorに結合し、mTORC1経路に影響を及ぼすことが報告されている。本研究は発生過程や病態進行におけるAstrinの役割とmTORC1経路との関連を明らかにすることを目的として、Astrinの欠損により腎低形成症(HPK)を呈し、慢性腎臓病を発症するラットを用いて、低形成腎の発生とネフロンの代償性肥大、成熟後の糸球体硬化や間質線維化におけるAstrinとmTORC1経路の役割を解析する。26年度は胎生期腎発生を調査した。雌ホモ個体に雄ヘテロ個体を交配し、帝王切開の2時間前にBrdUを投与し、胎齢14.5と15.5日の胎子を得た。胎子は腎臓を摘出しPFAで固定後、凍結切片かホールマウント標本を作製した。抗BrdU抗体により分裂活性を、リン酸化ヒストンH3抗体により分裂期を、TUNEL法によりアポトーシスを検出した。pancytokeratinとSix2の免疫染色により、尿管芽（UB）とUB末端に存在するキャップ間葉（CM）細胞を同定した。HPKではUBの分岐とCM領域が減少し、CM細胞の分裂活性の低下とアポトーシスの増加が見られたが、分裂期の細胞は正常と同じか少なかった。リアルタイムPCRでは、HPKにおいて後腎間葉で発現するsall1、kif26b、PAX2が低下し、mTORとその下流のp70s6kの発現が上昇しており、免疫染色でHPKのCM細胞でmTORの発現増強が認められた。これらのことから、HPKのネフロン減形成はCM細胞の増殖低下とアポトーシスの亢進に起因し、これらの異常にmTORC1の活性化が関与している可能性がある。Astrinは正常な数のネフロンを形成するために、特にCM細胞の維持に重要であると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
26年度は胎生期の腎臓発生におけるAstrinの役割とmTORC1経路との関連を明らかにすることを目的としていた。正常と比較したHPKの胎生期腎病理発生の解析により、HPKのネフロン数低下の原因としてキャップ間葉細胞における増殖低下とアポトーシスの亢進が見出された。さらに、この異常にmTOR経路の活性化が関与することを示唆する結果が得られたため、当初予定していた目的の主要な部分は達成されたと考えられる。しかし、Astrinを発現する細胞を同定するために行った市販抗体による免疫染色とin situ hybridizationの結果は良好ではなく、完全にはAstrin発現細胞を同定するに至っていない。また、腎臓の器官培養において、正常とHPKのin vivoでの腎発生をほぼ再現することに成功したが、mTORC1抑制剤のラパマイシンの投与はHPKで一部アポトーシスの抑制を示したものの、正常腎発生も攪乱したため、単純な評価ができなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
26年度に概ね目的が達成できたため、27年度は当初の予定通り、生後の腎臓の成長過程において主にネフロンの肥大におけるAstrinとmTORC1経路の役割を調査する予定である。この実験では生後のネフロンの形成期を過ぎた12日齢以降のHPKと正常ラットに対してラパマイシンを持続的に投与し、その後の腎臓の病態発生を臨床生化学、形態学、および分子生物学の手法により調査する。この実験においては、Astrinの発現動態を調査する予定であるが、26年度に行った市販抗体やin situ hybridizationによるAstrin発現細胞の同定は良好な結果を得ることができなかった。しかし、既に外注で作製してあったペプチド抗体において、腎臓の免疫染色によるAstrinの局在化に利用できる可能性のある抗体が見出されている。また、AstrinのN末側領域（35.1kDa）を合成し、発現タンパク質に対する抗体を作製する予定である。これらの抗体により、生後の腎臓の経時的な免疫染色とウェスタンブロッティングが可能になると思われる。また、胎生期腎臓の器官培養においてはさらに用量の検討や評価法の検討を行うと共に、Astrin発現細胞を同定した上で、Astrin発現単離細胞に対するラパマイシンの影響を直接評価することを合わせて検討する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
26年度の実験において、市販抗体の免疫染色やin situ hybridizationにより胎生期腎組織内でAatrinを局在化する予定であったが、予備実験の段階で良好な結果を得ることができなかったため、腎発生の経時的な解析を行わず、日齢を絞って解析を行った結果、次年度繰越金が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
繰越金については、現在有用な候補となっている外注作製したペプチド抗体による胎生期の経時的な解析を行い、これに使用する予定である。また、ペプチド抗体で良好な結果が得られなかった場合は、AstrinのN末側発現タンパク質に対する抗体を作製するため、この外注費にあてる予定である。
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