| 研究課題/領域番号 |
26450414
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| 研究機関 | 日本獣医生命科学大学 |
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研究代表者 |
鈴木 浩悦 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (50277662)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | astrin / mTOR / apoptosis / kidney / chonic kidney disease / nephron / mesenchymal cell |
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| 研究実績の概要 |
微小管結合蛋白質のastrinは分裂中期のHeLa細胞で紡錘糸や中心体に局在し、有糸分裂の進行に必要なだけではなく、間期ではmTORC1の活性化に必要なRaptorに結合して、mTORC1の活性に影響を及ぼすことが報告されている。本研究はAstrinの欠損によりネフロン数が減少し(腎低形成症(HPK))、慢性腎臓病を発症するラットを用いて、その病理発生におけるastrinとmTORC1経路の関わりを明らかにすることを目的としている。26-27年度の研究において、HPKラットの後腎形成過程ではネフロン前駆間充織(MM)細胞のアポトーシスが増加し、この異常にmTORシグナル経路の活性化が関わっている可能性があること、加齢期のHPKにおける腎不全の進行ががmTORC1阻害剤のeverolimus(EV)の長期投与で軽減することが示された。本年度では，後腎器官培養系におけるEV処置実験について、用量や解析法を再検討し，3日間の培養において、HPKの後腎の成長は正常より明らかに遅延するものの、EV処置によりHPKの後腎の成長が正常を上回り、正常とHPKの後腎でEVに対する反応性の相違が示された。さらに、1匹のラットからネフロン前駆MM細胞を単離培養する方法を確立し、これらの細胞がastrinを発現すること、正常と比べてHPK由来のMM細胞で幹細胞性の異常とアポトーシスの増加が起こっていることを示した。生後初期のHPKラットにおけるネフロンの肥大性変化におけるmTOR経路の関わりを評価するために、生後12日齢から2週間に渡り、成長障害の現れない用量でEV投与実験を行なったが、HPKの病態に対して明らかな影響は見られなかった。加齢期でのEV投与実験のデータを解析し、EV投与によりHPKの多飲多尿や血中尿素窒素の上昇が抑制され、病態軽減のメカニズムとして間質線維芽細胞の増殖抑制が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究はastrin欠損ラットの胎生期から加齢期までの長期間における腎臓の病態進行をmTOR経路との関連から解析しようとするものである。胎生期の解析についてはネフロン数が減少するメカニズムとして、mTOR経路の活性化を伴うネフロン前駆MM細胞のアポトーシスを明らかにした。また、加齢期の腎不全進行過程においてもeverolimusの投与実験から、mTORの活性化を伴う線維化が関わることを明らかにした。しかし、生後初期の肥大性変化に関する解析においては、everolimusの投与実験では明らかな変化を見出せなかった。astrinタンパク質の同定については、ウエスタンブロッティングに使用できる市販抗体を見出し、後腎のネフロン前駆間充織細胞を単離することでastrinを発現する細胞を特定した。しかし，正常ラットの生後初期の腎臓組織のウエスタンブロッティングではastrinの発現を確認することができなかった。後腎組織切片上でのastrinの発現の解析については、本年度に外注および作出した抗体についての条件検討がまだ終わっておらず、astrinの発現を局在かするまでには至っていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
胎生期の実験結果と加齢期の実験については論文化し公表を目指す。生後初期の実験に関してはeverolimusでの影響を同定することができず、ウエスタンブロッティングにおいては正常ラットの生後初期の腎臓においてastrinの発現を検出できなかった。生後のHPKラットで見られるネフロンの肥大性変化は、mTORやastrinの関与よりも、ネフロン数が少ないことに起因した代償性の他のシグナル経路の活性化によって生じている可能性が考えられる。従って、生後初期の腎臓において、正常とHPKラットとの間で、尿細管細胞の増殖や糸球体の肥大に関連した遺伝子の発現差異を調査する。さらに、市販および作出した抗体について、条件検討を継続して胎生期の後腎組織でastrinの局在化を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗体作製の外注費用において予定より安価な業者が見つかったたことと、作製した抗体の条件検討においてまだ良好な結果が得られていないため、その解析に要する費用が未使用となった。また、胎生期と加齢期のeverolimusの投与実験では、ほぼ予想通りの結果が得られたが、生後初期のeverolimusの投与実験では予備実験の段階で、病理学的解析において明らかな影響を検出することができず，実験方法や解析方法を再検討する必要性が生じた。このため、この部分の解析に要する費用も未使用となった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
作製した抗体の条件検討を行った上で、これまでに集めたサンプルについての解析の費用とする。また、生後初期の解析では、正常と発症の腎臓において細胞の肥大や増殖に関わる遺伝子発現の差異を中心に解析するための費用に充当する予定である。
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