| 研究課題/領域番号 |
26450500
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
大徳 浩照 筑波大学, 生命環境系, 講師 (30361314)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 寿命 / 老化 / 転写因子 / FOXO / DAF-16 / 線虫 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、独自に構築した線虫のin vivo lucシステムを駆使して、DAF-16をはじめとする長寿転写因子の活性を直接的・定量的に評価するとともに、それら転写因子による寿命延長メカニズムの解明を目指すものである。平成26年度の研究成果は以下の通りである。
1. daf-2長命変異体におけるDAF-16の活性と寿命延長との相関を検証すべく、DAF-16応答性Lucレポーター遺伝子を導入した線虫をdaf-2長寿変異体と掛け合わせ、そのLuc活性を野生型と比較した。意外なことにLuc活性に差はみられなかったが、Luc遺伝子のmRNA量は上昇していた。この結果はdaf-2変異体でDAF-16の転写活性は亢進していることを示すとともに、同変異体でグローバルに翻訳レベルが低下するという先行報告に一致する。
2. 様々な長寿シグナルにおける寿命調節転写因子の活性制御機構の解明するため、他の長寿転写因子であるSKN-1の活性化に応答する線虫の樹立し、現在その有用性を検証している。またDAF-16応答性Luc線虫は飢餓ストレスで転写が活性化するが、RNAi法により、このシグナルがTORを介していることが明らかになった。
3. in vivoにおけるDAF-16の翻訳後修飾の同定とその機能的意義の解析するため、FLAG-HA タグ付きのDAF-16を安定発現するトランスジェニック線虫を用いて、翻訳後修飾の同定を試みている。一方、培養細胞に発現させたDAF-16をアセチル化リジン抗体で精製し、MALDI-TOF/TOF MSに供することで、3カ所のアセチル化部位を同定した。現在までに、このうち２カ所についてリジンをアルギニンに置換した変異体を作製し、転写活性を評価している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請時に計画していた遺伝子組換え線虫は全て樹立済みであり、すでに解析を始めている。
またDAF-16の翻訳後修飾部位の同定にも成功しており、現在検討を行っている線虫からのDAF-16タンパク質の精製条件が整えば、さらなる進展が期待できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度以降は、すでに確立したLuc線虫を用いてDAF-16の活性化に関わるシグナル経路を同定するとともに、線虫からDAF-16タンパク質の精製して翻訳後修飾部位の同定を試みる。
また申請内容には記載しなかったが、CRISPR-Cas9システムによる線虫のゲノム編集にも成功しており、現在、DAF-16の転写活性化ドメインを欠失した変異体の作製にも取り組んでいる。
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