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2015 年度 実施状況報告書

セフェム系抗菌薬に対して触媒効率を高めたメタロ-β-ラクタマーゼの物理化学的解析

研究課題

研究課題/領域番号 26460037
研究機関熊本大学

研究代表者

山口 佳宏  熊本大学, 環境安全センター, 准教授 (10363524)

研究期間 (年度) 2014-04-01 – 2017-03-31
キーワードメタロ-β-ラクタマーゼ / β-ラクタム剤 / 亜鉛酵素 / 基質認識 / 触媒機構 / 結晶構造
研究実績の概要

本研究は、ほとんどすべてのβ-ラクタム剤を加水分解する酵素メタロ-β-ラクタマーゼ(MBL)の中で、特にセフェム系を非常に効率よく加水分解するKHM-1の機能解析を物理化学的手法を用いて行うことを目的としている。
KHM-1は、MBLであるIMP-1とアミノ酸相同性が約59%であるが、結晶構造の比較では、主鎖と二次構造ではほとんど差が見られなかった(論文執筆中)。IMP-1では基質がペニシリン系からセフェム系に変わると触媒活性が約10倍上がるが、KHM-1では約1000~10000倍上がる。このことから、KHM-1はセフェム系β-ラクタム剤を好んで加水分解することが知られている(J. Sekiguchi, et al., Antimicrob. Agents Chemother., 2008)。
平成27年度は、KHM-1の構造解析において高触媒に影響を与えていると考えられるアミノ酸残基に変異を加える実験を行った。KHM-1遺伝子を遺伝子操作用プラスミドに組み込み、変異を加えて大量発現系プラスミドに再度、組み直した。この変異プラスミドを大量発現用の大腸菌に導入し、KHM-1変異体の発現と可溶化、精製を行った。その結果、WildType(WT)と同様に高純度で大量精製することができた。
そこでKHM-1変異体のセフェム系β-ラクタム剤に対する加水分解活性を測定した。対照実験として、KHM-1(WT)とIMP-1で行った。現在、ペニシリン系β-ラクタム剤に対する活性と比較検討を行っている。
本研究は、MBLの基質認識機構と触媒機構の解明を目的としている。この研究成果は、未だ臨床上にないMBL阻害剤の開発につながることを期待している。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成26年度は、KHM-1の変異体調製に時間が掛かったが、平成27年度でようやくKHM-1変異体の調製を行うことができた。このことで、他の変異体調製を行う基盤ができた。幸い、KHM-1変異体は、WildTypeと同様に高純度で大量(数十mg)に調製することができた。
さらにKHM-1変異体の速度論的解析を行うことができた。このことから、KHM-1の基質認識機構の解明ができると考えられる。

今後の研究の推進方策

平成28年度は、本研究課題の最終年度である。KHM-1のセフェム系高触媒機構を解明するために、平成27年度とは違う変異体を調製して、そのアミノ酸の役割を検討する。
またKHM-1の高触媒機構は、KHM-1の活性中心にあるZn(II)イオンの影響も考えられる。キレート剤を使って、KHM-1の活性中心からZn(II)イオンを脱離させ、時間に対するキレート剤を入れていない時の相対活性から、KHM-1から脱離するZn(II)イオンの脱離速度を算出する。この結果から、同じMBLであるIMP-1と比較して、Zn(II)イオンの役割を検討する。

  • 研究成果

    (1件)

すべて その他

すべて 備考 (1件)

  • [備考] 酵素機能化学 山口研究室

    • URL

      http://yamaguchi-labo.jp

URL: 

公開日: 2017-01-06  

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