研究課題/領域番号 |
26460038
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研究機関 | 横浜市立大学 |
研究代表者 |
坂倉 正義 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (20334336)
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研究分担者 |
高橋 栄夫 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60265717)
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研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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キーワード | 構造生物学 |
研究実績の概要 |
リコンビナントFLAPが天然に近い状態で存在すると考えられる脂質二重膜中においてNMRを用いた構造解析、相互作用解析を行うことを目的として、Nanolipoprotein particle(NLPまたはナノディスク)中にFLAPを再構成するための条件検討を行った。この結果、POPC/POPG混合脂質を用いて調製したNLP中にFLAPを再構成することに成功した。次に、NLP中に可溶化したFLAP(以下FLAP/NLP)について、サイズ排除クロマトグラフィーによる5-lipoxygenase (5-LO)との相互作用解析を行った。しかし、相互作用形成に伴うFLAP/NLPおよび5-LOの溶出位置の変化は観測されなかった。解析対象の5-LOとして、これまでに結晶構造が報告されている安定化変異体を用いたが、この変異体において、脂質膜との相互作用形成に重要であると考えられている疎水性残基が親水性残基に置換されていることが、相互作用が観測されなかった要因の一つと考えられる。一方、FLAP/NLPと阻害剤との相互作用解析を行うため、メチオニン及びイソロイシンのメチル基に選択的に安定同位体標識(13C)を導入したFLAPを調製し、NLPに再構成した状態でNMRスペクトルを測定した。この結果、FLAPに由来すると考えられるシグナルが観測された。次に、FLAP/NLPに対して阻害剤であるMK-591を添加して、NMRスペクトルの変化を解析した。この結果、メチオニンに由来すると考えられるシグナルについて、MK-591添加に伴う強度減少が観測され、脂質二重膜中におけるFLAPとMK-591の結合が示唆された。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
NLP(ナノディスク)技術を応用することにより、FLAPを脂質二重膜中に可溶化した状態で、水溶性粒子として取り扱うことが可能となった。この結果、界面活性剤を全く含まない条件において、水溶性タンパク質である5-LOとの相互作用解析を行うことが可能となった。しかし、NLPはNMRによる観測対象粒子としてはサイズが大きく、感度が高いメチル基を標的とした解析を行った場合でも、全ての残基に由来するシグナルを観測することができなかった。
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今後の研究の推進方策 |
1、5-LOの安定化変異を野生型に戻したReversed mutantを調製し、FLAPとの相互作用解析を行う。 2、FLAP/NLPのNMR解析を行うため、(a) NLPの最小化を行うための条件検討、(b) bicelle等、FLAPを脂質二重膜中に可溶化するNLP以外の手法の検討、(c) タンパク質 and/or 脂質の重水素化によるNMR測定感度上昇の検討 を行う。
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次年度使用額が生じた理由 |
リコンビナントタンパク質の完全重水素標識を行うために、重水を購入するための予算を確保していたが、専ら重水を使用しない部位選択的重水素標識サンプルを調製したため、重水用に確保した予算を消費しなかった。
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次年度使用額の使用計画 |
NLP(ナノディスク)の調製において必要となる、合成脂質(POPC、POPG等)の購入に、予算を振り分ける。
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