| 研究課題/領域番号 |
26460055
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| 研究機関 | 独立行政法人日本原子力研究開発機構 |
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研究代表者 |
安達 基泰 独立行政法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 量子ビーム応用研究センター, サブリーダー (60293958)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | HIVプロテアーゼ / 薬剤耐性 / 不活性化酵素 / 結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
薬剤耐性ウイルスの出現は、現代の重要な医療問題の一つである。本研究では、後天性免疫不全症候群AIDS治療のための創薬標的タンパク質となっているHIVプロテアーゼ(HIVPR)に着目している。HIVPRのなかで、薬剤耐性を有する変異体の一つに、HIVPRの代表的な阻害剤[Ritonavir (RTV), Lopinavir (LPV)]に対して耐性を有するA17株由来のHIVPR (A17-HIVPR)がある。A17-HIVPRは、野生型と比較して酵素活性を保持したまま、阻害剤に対して親和性を減少させるという難解な特徴をもつ。野生型HIVPRおよびA17-HIVPRにおいて、基質および阻害剤との相互作用を、等温滴定型カロリメトリーおよび精密な立体構造解析（超高分解能X線および中性子構造解析）という2つの手法を用いて比較することにより、薬剤耐性獲得の分子機構を解明することを本研究の目的としている。
基質との相互作用解析において、通常、活性型酵素をそのまま使うと基質が分解されて解析が困難であるため、H26年度は、HIVPRの触媒基の一つを非解離性のAsn残基に置換し不活性化した酵素を設計し、発現プラスミドを作製後にタンパク質試料の調製を試みた。これまでに行っているHIVPRと遷移状態アナログの中性子結晶構造解析の結果から、基質複合体解析にはプロトン化を観測したAsp25のみをAsnに置換すべきであると考え、それを実現するため、HIVPRをコードする遺伝子2つを様々なリンカーで繋げることにより2量体を一本鎖化(single chain化)した不活性型HIVPR (WT-scHIVPR(D25N))を作製し、試料の調製を実施した。さらに調製した試料と阻害剤RTVとの複合体を作製し、1.2Åの高分解能X線結晶構造解析に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
H26年度は、2量体であるWT-HIVPRをリンカー配列で繋ぎ、一本鎖化したWT-scHIVPR およびA17-scHIVPRの調製を実施する予定であったが、試料の収率が悪く、調製が難航したことから、WT-HIVPRのリンカーについて適切な配列を検討することにとどまった。しかしながら、不活性型HIVPR (WT-scHIVPR(D25N))の調製と、調製した試料と阻害剤RTVとの複合体の1.2Åの高分解能X線結晶構造解析に成功し、当初の予定を上回る成果を得ることができた。高分解能X線結晶構造解析に成功したことで、次年度以降の試料調製に目処がたった。以上の進捗状況を総合的に考えて、本年度の達成度は「おおむね順調に進展している」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
H26年度において、試料調製の目処を立てたことから、H27年度は、試料の大量調製を実施して、阻害剤の親和力をITCにより解析を中心に実施する。測定条件は、予備検討によってすでに決定している。阻害剤の親和力(Kd)が非常に強い場合には、親和力の弱いPepstatinAの存在下で競合させ測定する。さらに不活性型酵素であるWT-scHIVPR(D25N）およびA17-scHIVPR(D25N)を用いて、基質に対する親和力(Kd)とΔH、ΔCp値を求め、野生型と薬剤耐性型の熱力学的パラメーターを比較する。H28年度(最終年度)は、WT-HIVPRおよびA17-HIVPRの立体構造を比較するために、各種試料について良質な結晶を取得し、超高分解能X線結晶構造解析を実施する。さらに不活性型酵素と基質複合体の中性子結晶構造解析を実施するための大型結晶の取得をすすめる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
WT-scHIVPRの試料調製が難航し、ITCによる解析にもちいる試料調製を次年度に延期したため。
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| 次年度使用額の使用計画 |
持ち越した試料調製費により、タンパク質試料の大量調製を実施する。
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