| 研究課題/領域番号 |
26460063
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
今中 常雄 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 教授 (50119559)
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| 研究分担者 |
川口 甲介 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (80624866)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | ABCトランスポーター / ペルオキシソーム / リソソーム / オルガネラ局在化機構 / 極長鎖脂肪酸CoA輸送 / ビタミンB12輸送 / 副腎白質ジストロフィー / ビタミンB12欠乏症 |
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| 研究実績の概要 |
ABCタンパク質サブファミリーDに属するABCD1ならびにABCD4について、ABCD1の極長鎖脂肪酸CoA輸送メカニズムとABCD4のリソソーム局在化機構を解析し、以下に示す成果を得た。
１．ヒトABCD1をメタノール資化性酵母Pichia pastoris に発現させ、ABCD1がペルオキシソーム膜に局在すること、ATPase活性とacyl-CoA thioesterase 活性をもつこと、ATPase活性が長鎖・極長鎖脂肪酸ならびにそのCoA体で活性化されることを見出した。
２．ABCD1を発現させたペルオキシソーム膜小胞を作製し、蛍光化合物NBDで標識したpalmitoyl-CoAの小胞内輸送を解析するためのassay系を構築した。NBD-palmitoyl-CoAのペルオキシソーム内への取り込みはATPで促進され、一部NBD-palmitic acidへと変換されていることを見出した。
３．ABCD4はリソソームタンパク質LMBD1と小胞体で複合体を形成し、リソソームへ移行することを示した。また、ABCD4とLMBD1との相互作用には、ABCD4の膜貫通helix 2と5が重要であることを明らかにした。さらに、LMBD1のリソソーム移行には、膜貫通helix 5と6のリソソーム側に配向したループに存在する232YERL配列が必要であること、そのアミノ酸をAlaに置換すると、LMBD1とともにABCD4は細胞膜に局在化することを示した。LMBD1との相互作用でABCD4の局在化が制御されている可能性が示唆された。
４．ヒトABCD4とLMBD1を酵母P. pastorisに発現させることに成功した。今後、ビタミンB12の輸送メカのズムを解析することが可能になった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトABCD1を酵母P. pastorisに発現させ、ABCD1の特性を明らかにするとともにABCD1を介した極長鎖脂肪酸輸送の解析系が構築できた。また、ABCD1がLMBD１と小胞体で複合体を形成し、リソソームへ移行することを示すことができた。よって、研究はおおむね順調に進展している。現在、ABCD1-Hisを精製、プロテオリポソームの作製を検討している。ABCD4、LMBD1については、P. pastorisでの発現系ができたので今後の機能解析が可能になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
平成２６年度の進展状況を踏まえ、以下の２項目を中心に解析を行う。
１．ABCD1の極長鎖脂肪酸CoA輸送機構の解析
野生型ならび変異型ABCD1を発現したペルオキシソーム膜小胞を用い、極長鎖脂肪酸CoA輸送の詳細を解析する。また、ABCD1-Hisの精製に成功しており、プロテオリポソーム作製の条件を検討している。プロテオリポソームを用いた、より詳細な基質輸送機構を解析したい。
２．ABCD4のリソソーム局在化機構とビタミンB12輸送機構の解析
CRISPR/Cas9システムでLMBD1をノックアウトした細胞を作製し、内在性ABCD4の局在がLMBD1で制御されていることを検証する。ABCD4ならびにABCD4とLMBD1を共発現させた膜小胞を発現させ、ビタミンB12輸送機構を解析する。LMBD1のビタミンB12輸送における役割にも着目する。
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