| 研究課題/領域番号 |
26460068
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| 研究機関 | 奥羽大学 |
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研究代表者 |
西屋 禎 奥羽大学, 薬学部, 教授 (80399831)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | SPSB / iNOS / CDC14A / FOG-2 / CTTNBP2 / Nrf3 / ユビキチン化 |
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| 研究実績の概要 |
新規E3ユビキチンリガーゼECS(SPSB)の生理的役割を明らかにするために，ECS(SPSB)の機能を可逆的に抑制することができる細胞株の樹立を行った．具体的には，iNOSやCDC14AといったECS(SPSB1,2,4)の基質を発現するヒト肺胞基底上皮細胞株のA549細胞に，ECS(SPSB1,2,4)の機能を特異的に抑制することが分かっているiNOSのN末1～124アミノ酸部分（以下，ECS(SPSB1,2,4)インヒビター）を，Tet-OFFシステムを用いて可逆的に発現させることを試みた．第一段階として，pRevTet-OFFベクターをA549細胞に導入し，得られたA549-TetOFF細胞に，第2段階としてpRevTRE-hiNOS(1-124)-FLAGベクターを導入した．こうして得られたA549-TetOFF-hiNOS(1-124)-FLAG細胞は，その培養液からドキシサイクリンを除去すると，12時間以内にECS(SPSB1,2,4)インヒビターの発現が誘導され，そこにドキシサイクリンを加えると，その発現が停止することを確認した．さらに，iNOSおよびCDC14Aの寿命がECS(SPSB1,2,4)インヒビターの発現によって著しく延長されることや，細胞増殖の抑制が起こることを見出した．
また，今年度は，4種類存在するSPSBファミリー分子の中で，一次構造や生化学的性質が他のメンバーと著しく異なり，かつ基質が同定されていないSPSB3について，酵母ツーハイブリッド法を用いた網羅的な基質探索を行い，SPSB3に特異的に結合する蛋白質としてNrf3を同定した．さらに，ECS(SPSB3)はNrf3をユビキチン化するが，その分解は誘導しないことを見出した．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は，iNOSやCDC14AといったECS(SPSB1,2,4)の基質を発現するA549細胞に，ECS(SPSB1,2,4)インヒビターを発現させるためのTet-OFFシステムを導入することにより，ECS(SPSB1,2,4)の機能を可逆的に抑制することができるA549細胞株を作出することに成功した．さらに，この細胞においてECS(SPSB1,2,4)の機能抑制が，iNOSやCDC14Aの分解を著しく延長することや，A549細胞の増殖を抑制することを明らかにした．また，酵母ツーハイブリッド法による網羅的スクリーニングにより，SPSB3の基質を世界で初めて同定することができた．このことから，本研究計画は概ね順調に進展していると考える．
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| 今後の研究の推進方策 |
ECS(SPSB1,2,4)の基質であるFOG-2やCTTNBP2を発現する細胞株（例，MDA-MB-231細胞，SH-SY5Y細胞など）においても，ECS(SPSB1,2,4)インヒビターを可逆的に発現することができるシステムを導入し，ECS(SPSB1,2,4)の基質の分解異常に起因する様々な異常を見出す．さらに，個体レベルでのECS(SPSB1,2,4)の生理的意義を明らかにするために，培養細胞系での実績を基に，ECS(SPSB1,2,4)インヒビターを可逆的にマウスに発現させるためのTetシステムのベクター系の構築を行う．また，ECS(SPSB3)によるNrf3の機能制御を明らかにするために，Nrf3の転写調節機能に対するNrf3のユビキチン化の影響を検討する．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
購入予定であった生化学実験試薬を用いる実験が延期になり，その試薬を購入しなかったため．
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| 次年度使用額の使用計画 |
延期になっていた実験を行う目途がついたので，次年度使用額をその実験に必要な試薬の購入に当てる予定である．
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