| 研究課題/領域番号 |
26460079
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| 研究機関 | 星薬科大学 |
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研究代表者 |
高橋 典子 星薬科大学, 薬学部, 教授 (50277696)
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| 研究分担者 |
今井 正彦 星薬科大学, 薬学部, 助教 (40507670)
高橋 勝彦 星薬科大学, 薬学部, 准教授 (80307066)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | レチノイン酸 / レチノイル化 / タンパク質修飾 / シグナル伝達 / プロテインキナーゼA / 遺伝子発現調節 |
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| 研究実績の概要 |
生命の維持に重要な作用を示すレチノイン酸 (RA) は、ヒト前骨髄性白血病細胞 (HL60細胞) に対し強力な細胞分化誘導能を持つことから、現在急性前骨髄球性白血病患者の治療に使われている。本研究ではRA作用の核内受容体とは別の作用機構として、cAMP依存性リン酸化酵素 (PKA) 等のシグナル分子 および ヒストン等の核内タンパク質へのレチノイル化反応 (RAによる翻訳後タンパク質修飾) があることを証明し、RAのエピジェネティクス制御作用という新しい概念を提唱することにある。本年度は、cAMP-PKAと同様に、ホルモン等の細胞外シグナルの増幅、分配、応答に関わる細胞内新規レチノイル化シグナル分子を検出・同定する、核内レチノイル化PKAによる核内タンパク質のリン酸化を調べ、RA処理後PKAにより新たにリン酸化される新規核内リン酸化タンパク質を検出・同定する、並びに、各ヒストン修飾へのRAの影響を調べることを検討した。先ず、RA処理したHL60細胞から調製した抽出画分中のタンパク質をMono Qカラムで分離し、溶出画分のタンパク質を一次元電気泳動により分離後、RA抗体を用いて免疫染色を行った。その結果、既に同定されているタンパク質とは異なる挙動を示す新たなレチノイル化タンパク質を検出することができた。現在、二次元電気泳動法によりタンパク質を分離・検出し、同定を行っている。また、RA処理したHL60細胞から核を単離し、抽出した核内タンパク質を二次元電気泳動により分離後、抗リン酸化-PKA基質抗体と抗RA核内受容体抗体を用いて免疫染色を行った。近接するタンパク質が染色されたことから、受容体のリン酸化に関わる可能性が示唆されたが、さらなる検証を必要とする。さらにヒストンの修飾にRAが与える影響を解析するため、HL60細胞からクローニングしたヒストンのcDNAの3’末端にFLAG配列を付加し、これをCMVプロモーター下流に導入した発現プラスミドを構築することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
レチノイル化タンパク質等の同定に時間と労力を要しているが、現在のところほぼ計画通りに進んでいる。平成27年度に予定していた実験も組み入れ、研究を進めている。忍耐強く実験を行い、着実に結果を出していきたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
新規のレチノイル化タンパク質の同定を随時行う。また、核内タンパク質のレチノイル化の生体内意義を、先ずはレチノイル化PKAによる核内タンパク質（ヒストンを含む）のリン酸化へのRAの影響を詳細に調べ、解明していく。次いで、他のタンパク質修飾で、遺伝子の発現調節に関わるアセチル化、メチル化、ユビキチン化について解析し、RAのエピジェネティクス制御作用機構を明らかとする。さらに、これらの機構を制御する因子の探索を行い、医薬品としての可能性を検証していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初、レチノイル化タンパク質を分離した後、検出・同定を行っていたが、二次元電気泳動によるタンパク質の分離とSYPRO染色、免疫染色による検出・解析に長時間を要した。同定が年度を跨ぐことになったため、この経費の使用額が生じた。また、26年度の時間をより有効に使うため、27年度以降に行う予定であった「ヒストンの修飾部位特異的変異体導入細胞に及ぼすRAの影響の解析」に必要なヒストンのcDNAクローニングと発現プラスミドの構築を前倒しして26年度に行った。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は、タンパク質の同定に必要なMALDI/TOF-MS関連、及び、免疫染色に必要な物品費に使用する。
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