| 研究課題/領域番号 |
26460088
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
久野 悠 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 基礎科学特別研究員 (60467636)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 人工ヌクレアーゼ / ゲノム編集 / ノックイン / CRISPR/Cas9 system |
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| 研究実績の概要 |
これまでマウスでは生殖細胞へと分化可能な胚性幹(ES)細胞が樹立されているため、相同組換えによりゲノムを編集した個体の作製が可能であった。これにより標的遺伝子を破壊した際の表現型を解析する逆遺伝学的解析が進められ、多くの遺伝子の生理機能がマウスを中心に解明されてきた。一方で世代時間や飼育コスト、ゲノムサイズ、観察の容易さなどから研究目的に適した様々なモデル生物が利用されているが、マウス以外のモデル生物ではES細胞が樹立されておらず逆遺伝学的解析が困難であった。このような状況下で近年、ゲノムの標的部位にDNA二本鎖切断を引き起こす人工ヌクレアーゼであるTALENやCRISPR/Cas9システムが開発され大きく注目されている。
人工ヌクレアーゼによってDNA二本鎖切断が引き起こされると、細胞が持つ二種類の修復機構が働く。１つは非相同末端結合修復と呼ばれるもので、切断末端が直接繋がれる。この際に高頻度で数塩基の挿入及び欠損変異が生じるため、フレームシフトを誘導し標的遺伝子が破壊される。もう１つは相同組換え修復で、切断部位と相同配列を持つ鋳型を利用して修復するため外来遺伝子を挿入・置換することが可能である。CRISPR/Cas9システムではgRNAが標的配列の認識に関わり、Cas9ヌクレアーゼと複合体を形成することによりDNA二本鎖切断を引き起こす。効率の良い遺伝子挿入を行うため、gRNAの認識配列とゲノム標的部位との相同配列を持つドナーベクターを作成した。このドナーベクターと細胞ゲノムの標的部位を切断するCRISPR/Cas9システムを同時に導入することにより、哺乳類培養細胞において外来遺伝子が挿入されることを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画予定通り、ゼブラフィッシュ胚に加えて培養細胞においても本研究にて開発した手法が機能することを確認できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
遺伝子挿入が次世代に効率良く引き継がれるためにはインジェクションを行ったF0世代の体細胞において広範囲でゲノム編集が行なわれている必要があることを見出している。ゼブラフィッシュ胚の出来るだけ発生初期にゲノム編集が引き起こされるようにすることで更に遺伝子挿入効率を上げられないか検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額は４５円であり、ほぼ予定通り使用した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度使用額は４５円であり、当初の計画通り使用する。
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