| 研究課題/領域番号 |
26460131
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| 研究機関 | 東京薬科大学 |
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研究代表者 |
黒田 明平 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (80266890)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 表面プラズモン共鳴 / aldose reductase / Achillea millefolium / キナ酸誘導体 |
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| 研究実績の概要 |
表面プラズモン共鳴を用いた植物資源からの抗生活習慣病のシーズ探索法の確立のため、以下の研究内容について実施した．
１）生活習慣病関連酵素のセンサーチップへの固定化条件と検討
２）生活習慣病関連酵素を有する植物抽出エキスの調製および酵素阻害活性
生活習慣病関連酵素として糖尿病の合併症である糖尿病性網膜症に関与するaldose reductase（AR）のセンサーチップ（CM5）へのアミンカップリング法などを用いての固定化条件の検討を行ったが、シーズ探索に適するAR固定化センターチップの調製には至っていない。また上記１）と並行し、生活習慣病のシーズ探索用の植物抽出エキスの調製を行った。38種のMeOH抽出エキスについて既存の方法（マイクロプレート、吸光度計使用）を用いてAR阻害活性を評価した結果、Agrimonia eupatoria 地上部（IC50:8.13μg/mL）、Betula alba 樹皮（13.1μg/mL）、Achillea millefolium 地上部（6.66μg/mL）、Tussilago farfara葉（3.34μg/mL）に強い阻害活性が認められた。このうち、A. milleforimu 地上部のMeOH抽出エキスをDiaion HP-20カラムクロマトグラフィーに付し、20%MeOH、EtOH、EtOAcと順次極性を下げながら溶出させた。その結果、EtOH溶出画分に活性が集中（6.00μg/mL）したため、同画分について分離を行った結果、14種の化合物を単離し、それらの構造を明らかとした。このうち、ジカフェオイルキナ酸誘導体に強いAR阻害活性が認められた．ARを固定化したセンサーチップの調製が完了した後には、マイクロプレートを用いた既存の方法との同等性の評価のため、A. milleforimu 地上部のMeOH抽出エキスを用いて評価する予定である．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
表面プラズモン共鳴を用いた酵素阻害活性試験に関する論文報告数は少なく、センサーチップへのaldose reductaseの固定化に関する論文報告は確認出来ていない。そのため、他の酵素の固定化方法が記載してある論文報告を参考に実験を進めたことから、条件検討を効率よく進めることが出来なかった。現在検討している方法はリガンドとして高分子のタンパクなど、アナライトとして低分子化合物とするため、より多くのリガンドをセンサーチップに固定化することが必要であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
Aldose reductase（AR）、PPAR-γ リガンドバインディングドメイン（LBD），PTP（Protein tyrosine phosphatase）1Bのセンサーチップ（CM5）への固定をアミンカップリング法あるいはキャプチャー法などを用いて検討する．LBDあるいは酵素を固定化したセンサーチップのリガンドとアナライトとの相互作用をセンサーグラムから評価する．一方，既存の方法によっても陽性対照物質のリガンド活性（比活性値）および酵素阻害活性（IC50値）を算出する．SPRバイオセンサーにより算出された陽性対照物質のKD値と既存の方法により求められたリガンド活性あるいはIC50値について検量線を作成し、相関係数が算出することで同装置による評価が適切であると評価する。シーズ探索に適するAR固定化センターチップの調製が完了した場合、平成26年度の研究成果によりAR阻害活性が確認されたキク科 A. milleforimu 地上部のMeOH抽出および含有される活性化合物について評価を実施する。
平成26年度においてAR阻害活性を示したキク科 Tussilago farfara葉およびバラ科 Agrimonia eupatoria 地上部のMeOH抽出エキスについて成分探索を実施し、活性化合物の同定を行い、センサーチップでの評価に提供可能なサンプル（MeOH抽出エキスおよび活性化合物）の調製を行う。
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