| 研究課題/領域番号 |
26460259
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
松下 文雄 藤田保健衛生大学, 医療科学部, 准教授 (50298543)
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| 研究分担者 |
亀山 俊樹 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助教 (60298544)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | NZF / Myt / neural zinc finger / ミエリン / 変異マウス / 神経回路 / 関節拘縮 / 転写因子 |
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| 研究実績の概要 |
１. 組織学的解析
NZF-2-/- マウスおよびNZF-2-/-；NZF-3-/- マウスでは、出生直後に呼吸不全により致死となる。脊髄神経の神経発生異常について、野生型、NZF-2-/-、NZF-3-/-、NZF-2-/-；NZF-3-/- の各遺伝子型のマウス個体について、組織学的に比較解析を行っている。ニューロフィラメント陽性神経線維を調べたところ、NZF-2-/-；NZF-3-/- では、四肢の先端部への神経投射が不全であった。原因として、脊髄神経細胞の増殖の減少、神経細胞分化の不全、神経細胞分化後の細胞死の増加が考えられた。
２. 遺伝子発現変化解析
NZFファミリー遺伝子産物はzincフィンガーを有しDNAに結合する転写因子の構造を持つため、ノックアウトマウスでは下流遺伝子の発現変化が予想される。野生型とNZF-2-/-；NZF-3-/- マウスの個体について、NZF-2とNZF-3の発現が際だって強い12日胚頭頸部から全RNAを抽出し、遺伝子発現解析を行った。マイクロアレイ解析を行った結果では、神経細胞の減少の結果とも考えられる一部遺伝子の発現低下を除き、遺伝子発現の大きな変化は見られなかった。このことから、NZF-2-/-；NZF-3-/- マウスの神経回路形成不全は、遺伝子の単なる発現量変化ではなく、選択的スプライシングパターンの変化という、より繊細な変化が寄与している可能性を考えている。ヒトの脳機能の高次化を生んだ要因の一つとも予想される遺伝子の選択的スプライシングパターンの変化が、マウスの脳の形成・機能発現過程で起きていれば興味深い。
３． 成果発表
組織学的な解析を進める上で比較対照となる野生型マウスにおけるNZFファミリー遺伝子転写産物の発現分布を、胎児期の神経系発生期について詳細に解析した結果がDevelopmental Dynamics誌に掲載された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
NZF-2/-3ダブルノックアウトマウスでは、組織学的にいくつかの部位において神経系の形成不全が認められることがわかった。その原因としていくつかの要因が考えられたが、それを判別あるいは推測できるだけの、より詳細な組織学的解析を蓄積できていない。
また、NZF-2/-3ダブルノックアウトマウスと野生型マウスについて、マイクロアレイにより遺伝子発現を比較したところ、神経回路形成不全の結果と考えられる一部の遺伝子を除き、遺伝子の発現量に大きな変化がないことがわかった。しかし、単なる遺伝子の発現量変化ではなく、選択的スプライシングパターンの変化が表現型に影響している可能性が考えられた。より細かな脳の領域分けによるサンプリングも含め、その解析はまだ準備段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
NZF-2/-3ダブルノックアウトマウスで認められる脊髄の神経線維形成不全の原因について、組織化学的に詰めていきたい。脊髄神経細胞の増殖の減少の可能性については細胞増殖（BrdUの取り込み率）を、神経細胞分化の不全の可能性については分化マーカーIsl-1の抗体染色を、神経細胞分化後の細胞死の増加の可能性についてはTUNEL法または抗Caspase-3抗体染色により、検討解析する。その際、野生型とNZF-2-/-；NZF-3-/- ダブルノックアウトマウスだけでなく、NZF-2-/-、NZF-3-/- のシングルノックアウトマウスの組織学的解析も詳細に行い、比較検討する。
遺伝子発現解析については、解析対象を選択的スプライシングパターンの変化にまで拡張し、エクソンアレイ・RNA-Seqを用いて比較検討する。試料には、NZF-2とNZF-3の発現が際だって強い12日胚終脳を用い、大脳皮質を含む背側領域と基底核原基を含む腹側領域の切り分けを行う予定である。
また、出産直後に致死となるノックアウトマウスを用いる実験には制約があるため、機能確認実験として当初考えた組織培養系だけでなく、細胞培養系も検討したい。古典的な基質上の軸索伸長や生存率の解析に、細胞株で効果の確認できているRNAiを用いた機能阻害を組み合わせてできることを検討したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
組織化学的研究に用いる抗体類は手持ちの試薬の残りを用い、新規に購入せずに済んだこと、また遺伝子発現解析について、すべての遺伝子型のマウスについて調べたり、サンプル数を増やしたりまだできていないため、当初平成26年度使用予定の予算を次年度に繰り越すことになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
細胞組織化学および培養用の試薬購入、遺伝子発現解析用試薬キットの購入に充てる予定である。
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