| 研究課題/領域番号 |
26460259
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
松下 文雄 藤田保健衛生大学, 保健学研究科, 准教授 (50298543)
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| 研究分担者 |
亀山 俊樹 藤田保健衛生大学, 総合医科学研究所, 助教 (60298544)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | neural zinc finger / myelin / transcription factor / 神経発生 / 神経回路 / 関節拘縮 / 遺伝子破壊マウス / トランスクリプトーム |
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| 研究実績の概要 |
１. 組織学的解析
NZF-2ノックアウトマウスおよびNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスでは、出生直後に呼吸不全により致死となる。NZF-2/-3ダブルノックアウトマウスでは、さらに四肢の先端部への神経投射不全や、大脳皮質の特定の場所で神経線維の欠失が認められている。これらの神経発生異常について、野生型、NZF-2-/-、NZF-3-/-、NZF-2-/-；NZF-3-/- の各遺伝子型のマウス個体について、組織学的な比較解析を続けているが、原因は特定できていない。
２. 遺伝子発現変化解析
NZFファミリー遺伝子産物はzincフィンガーを有しDNAに結合する転写因子の構造を持つため、ノックアウトマウスでは下流遺伝子の発現変化が予想される。NZF-2とNZF-3の発現差の大きい12日胚頭頸部全体のRNAを用いた遺伝子発現解析では、野生型とNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスの個体で、遺伝子発現の大きな変化は認められていない。このことから、限局した場所での発現の変化や選択的スプライシングパターンの変化など、より繊細な変化を想定している。このため、脳の領域の区分けやより限定した領域のサンプリング方法の試行、またエクソンアレイ解析を準備中である。さらに、特定の細胞レベルでのパスウェイ解析的な手法も、検討を続けている。
３． 成果発表
ダブルノックアウトマウスと共に比較解析している単独遺伝子のノックアウトマウスであるNZF-2ノックアウトマウスおよびNZF-3ノックアウトマウスについて、これまでの知見をまとめた論文発表を準備中である。これらの知見はNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスの表現型の比較対照となるものである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
１．組織学的解析の困難さ：NZF-2/-3ダブルノックアウトマウスで認められる神経線維の消失について、発生過程でその経過を追って失われる神経を特定するのは難しい作業で、ある程度想定されていたことだが、細胞レベルでどの神経細胞がいつ失われるのかを特定するのが難しい。
２．発現解析用の部位を限局した組織のサンプリングも難しく、安定した手技が得られていない。
３．実験材料の入手が滞ったこと：昨年度から今年度にかけて、学内の動物飼育施設のクリーンアップに伴う一時閉鎖により、飼育とサンプリングが一時できなくなっている。平成29年6月から飼育再開の予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
4年度目に入るので、成果を獲得のため、共同研究者との連携と議論をより緊密に行う。
組織学的なアプローチについては、NZF-2ノックアウトマウスとNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスで認められる脊髄の神経線維形成不全の原因については、失われる神経細胞を細胞レベルで場所と時期を同定するのは難しいが、諦めず続ける。
遺伝子発現解析については、解析の精度を上げるため、細胞レベルでの発現比較を念頭に、脳の限局した領域や細胞の正確なサンプリング手法を確立する。そして、選択的スプライシングパターンの変化に対応した、エクソンアレイ・RNA-Seqを用いたトランスクリプトーム解析を行う。
また、出産直後に致死となるノックアウトマウスを用いる実験には制約があるため、機能確認実験として当初考えた組織培養系だけでなく、細胞培養系も考えている。また、細胞株を用いた論文発表済みの実験で効果の確認できているRNAiを用いた機能阻害効果も有効に活用したい。
ダブルノックアウトマウスと共に解析を進めて来たNZF-2ノックアウトマウスとNZF-3ノックアウトマウスについての知見を論文の形にまとめ、是非アウトプットを出したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
高価な解析キットを用いて遺伝子発現解析を行う前にサンプリング方法を慎重に検討していたこと、動物飼育施設の一時閉鎖のため実験動物の飼育とサンプリングが一時的に滞っったことによる。そのため、当初平成28年度使用予定の予算を次年度に繰り越すことになった。
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| 次年度使用額の使用計画 |
マウスの飼育維持、解剖用の試薬器具、遺伝子発現解析用試薬キットやパスウェイ解析委託、組織化学や培養等の試薬器具の購入に充てる予定である。
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