| 研究課題/領域番号 |
26460259
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| 研究機関 | 藤田医科大学 |
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研究代表者 |
松下 文雄 藤田医科大学, 保健学研究科, 准教授 (50298543)
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| 研究分担者 |
亀山 俊樹 藤田医科大学, 総合医科学研究所, 助教 (60298544)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | neural zinc finger / myelin / transcription factor / 神経発生 / 神経回路 / 関節拘縮 / 遺伝子破壊マウス / トランスクリプトーム |
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| 研究実績の概要 |
１. 組織学的解析
NZF-3ノックアウトマウスは致死ではないが、NZF-2ノックアウトマウスおよびNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスでは、出生直後に呼吸不全により致死となる。その死因は、NZF-2ノックアウトマウスの解析から横隔神経の繊維形成不全と推測される。NZF-2/-3ダブルノックアウトマウスの予備的な検討では、さらに四肢の先端部への神経投射不全や、大脳皮質で一部の神経線維の欠失を確認している。そこで、野生型、NZF-2-/-、NZF-3-/-、NZF-2-/-；NZF-3-/- の各遺伝子型のマウス個体について、連続切片で組織学的な比較検討をおこなった。
２. 遺伝子発現変化解析
NZFファミリー遺伝子産物はzincフィンガーを有しDNAに結合する転写因子の構造を持つため、ノックアウトマウスでは下流遺伝子の発現変化が予想される。NZF-2とNZF-3で発現量の一過的な増加が見られる12日胚を用い、頭頸部全体のRNAを用いた遺伝子発現解析を行った。その結果、野生型とNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスの個体間で、遺伝子発現の大きな変化は認められなかった。野生型の発現解析から神経分化のステージでNZF-2とNZF-3が発現量の極大を迎える場所と時期は限局し、かつそれらは両遺伝子間で少しズレがある。そのため、神経系の部位や時期をより限局した詳細な発現解析が求められるが、技術的な困難が解決できていない。そこで、発現を比較するサンプルを詳細に絞り込むのではなく、同じサンプルでも、比較する発現の変化を選択的スプライシングパターンにまで広げて、野生型との違いを見出そうとしている。
３． 成果発表
これまで得られている知見について、NZF-2/-3ダブルノックアウトマウス、および共に解析してきたNZF-2とNZF-3の単独遺伝子ノックアウトマウスについて、発表論文を準備中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
従来から、組織レベルと遺伝子発現レベルの双方の解析で、より詳細に限局した領域での解析を必要としていたが、進められていなかった。さらに、学内の動物飼育施設のクリーン化に伴い、施設が一時閉鎖され、遺伝子改変マウスは凍結受精卵でガラス化保存し、飼育交配が一時期途絶えることになった。そうした実験の遅れが、2018年度も継続する形となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
5年計画の最終年度の後に、1年の研究延長を認めていただけたので、成果の発表を目標に、研究を進める。そのために、共同研究者と緊密に連携し、今まで得た成果をまとめて論文としてアウトプットすることに注力する。論文は、NZF-2シングルノックアウトマウス、NZF-3シングルノックアウトマウス、そしてNZF-2/-3ダブルノックアウトマウスについての知見をまとめる予定である。
組織学的解析でも、遺伝子発現解析においても、より限局した領域での解析には、解剖の手技的に予期された困難が伴う。そこで、これまでに得た遺伝子発現情報と、既存の培養細胞を用いた神経分化の実験系（論文発表済みのP19細胞を用いた神経分化の実験系；T.Kameyama, 2012 Neurosci. Lett.）を活用し、NZFが発現の制御に関わる可能性のある遺伝子の検証を試みるなど、別のアプローチも検討したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
動物飼育施設の一時閉鎖により前年度も予定が遅れており、それを引き継ぐ形となった。そのため、当初2018年度に研究期間を終える予定であったが、研究結果をまとめるために1年の延長を申請し、使用予定だった予算を次年度に繰り越すこととした。
マウスの飼育維持、各種実験機器・器具・試薬の購入、データの解析、まとめの論文作成に関わる費用に充てる予定である。
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