| 研究課題/領域番号 |
26460280
|
|---|
| 研究機関 | 大阪市立大学 |
|---|
研究代表者 |
小川 登紀子 大阪市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (30382229)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| キーワード | 細胞・組織学 / ストレスモデル / 蛋白分解系 / 細胞死 / 微細形態 |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、持続的ストレスを負荷したラットモデルの下垂体中間葉のホルモン分泌細胞、メラノトロフに起こる細胞死の系を用いて、慢性的ストレス下に起こる細胞死メカニズムを明らかにしようとしている。メラノトロフの細胞死は、形態学的特徴の異なる細胞死像が同時に観察され、複数の細胞死メカニズムが介在すると考えられる点でユニークな細胞死である。一方で、すべての細胞死には、蛋白や細胞内小器官の分解・リサイクルの過程に異常が生じていると考えられ、最終的にネクローシス様細胞死の形態を示す、という２つの共通点があった。
ストレスが続くことで異常な蛋白や小器官が生じるが、これらを分解し再利用することは、細胞の恒常性を維持するために極めて重要である。ストレスを受けたラットのメラノトロフでは当初、分解・再利用の機構が活性化するが、ストレスが長引くことで次第に停滞し、このことが新たなストレスとなっていることがわかってきた。すなわち、このような細胞内分解系の異常とそれによって引き起こされる細胞死は、慢性的なストレス時に特有の現象と考えられる。
メラノトロフ細胞死像には細胞膜の破綻が確認され、ネクローシスと呼ばれる細胞死と考えられた。ネクローシスは細胞内容物が漏れだすことから、しばしば局所炎症の原因となり周囲の細胞に影響を及ぼす危険性がある。ラットメラノトロフの培養系において、蛋白分解系を阻害する薬剤の効果を確認したところ、複数の阻害剤で、細胞膜の破綻を伴う細胞死が起こることが確認された。これにより、蛋白分解系の異常と細胞膜の破綻の関連が示唆された。
“慢性的なストレスが蛋白分解系に異常を生じさせる”という視点から、下垂体以外の組織においても、蛋白分解系の変化が生じていないかスクリーニングを行った。その結果、複数の組織において蛋白分解系の亢進が認められ、その一部に異常を示す細胞が確認された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成２６年度の研究計画として、メラノトロフの細胞死過程における細胞内小器官の様々な形態変化は蛋白分解系の異常に基づくものであり、ミトコンドリアの形態変化（機能異常）が引き金となって生じるとする仮説について、主に形態学的側面から検討を行った。この内容については、論文執筆中である。
メラノトロフの初代培養系を用いた細胞死の再現は、成功には至っていないが一定の進展があった。ラットモデルのメラノトロフに起こる細胞死は、ホルモン合成が活性化した後、細胞膜の破綻を伴うネクローシス様の細胞死形態を示す。そこで、メラノトロフのホルモン合成を活性化させた状態で、複数の蛋白および細胞内小器官の分解阻害剤を添加し、ネクローシスの再現を行った。このうち、２種類の阻害剤により、目的とする細胞膜の破綻を伴う細胞死が観察された。この結果から、当初予測した通り、活性化したメラノトロフでは蛋白分解系の異常がネクローシス様細胞死の直接的な引き金になりうることが示唆された。
また、当初の計画には含まれていなかった成果として、ラットモデルの様々な組織を調べたところ、下垂体中間葉以外の組織においても蛋白分解系に変化が生じていることがわかってきた。これらの組織では、通常から細胞のターンオーバーのために一定レベルで細胞死が起こっているが、持続的ストレスにより細胞死が増加するか、あるいは細胞死の形態が変化することが予測された。これらの組織は、メラノトロフの細胞死と同一の視点で解析できる対照となると考えている。
以上、当初の実験計画はほぼ遂行できたが、年度内に予定していた論文投稿は次年度に持ち越した。一方で当初の計画に含まれていなかった、持続的ストレス状態における細胞死の新たな研究対象として、下垂体中間葉以外の組織を見いだすことができた。これらを総合すると全体としてはおおむね計画通りに進行していると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
1. メラノトロフの細胞死メカニズムに関して、これまでの微細形態学的解析から、細胞変性の過程で蛋白凝集体の蓄積と形態異常を示す細胞内小器官が併存し、その後細胞死が起こるという経過が明らかになった。メラノトロフの初代培養系を用いた実験から、蛋白分解の停止がネクローシスの原因となることが示唆された。しかしながら、細胞内小器官の形態異常は再現されておらず、ミトコンドリアの異常が鍵となると考えられる。そこで次年度は、蛋白分解系の異常とミトコンドリア機能の関連に絞り、メラノトロフの初代培養系を用いた研究を中心に実験を行う。
2. 本研究のもう一つの目的として、メラノトロフの細胞死過程で一部の細胞に発現する転写因子CHOPの機能解析があり、次年度はこれを推進する。これまでに、ラットモデルを用いてCHOPを発現するメラノトロフの形態学的特徴はある程度明らかになった。しかしながら、ラットモデルでは機能解析に限界があるため、CHOPにノックアウトマウスを用いた解析を中心に行う。マウスに薬剤投与することで活性化させたメラノトロフには、ラットモデル同様にCHOP分子が発現する。この系を用い、CHOPの機能解析を行う。
3. ラットモデルにおいて新たに蛋白分解系の異常が認められた組織の解析を進める。蛋白分解系に異常の認められた組織が複数確認されたが、研究対象としては、蛋白分解の異常に基づく細胞死が起こることが必要である。そこでまず、蛋白分解の異常に基づく細胞死が起こる細胞を明らかにする。その上で次年度中に、持続的ストレス下で細胞死につながる経時的変化を解析する。具体的には、(1) 蛋白分解関連分子の発現や局在を解析（ウエスタンブロット、免疫組織染色）。(2) 微細形態観察による細胞内小器官の形態変化を解析。(3) 細胞死像の確認と形態学的解析、を予定している。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初は本年度中に論文投稿を予定しており、校閲および投稿料として予算を計上していたが、投稿に至らなかった。また、学会参加のために旅費および宿泊費の支出を予定していたが、本年度は遠方の学会への参加がなかったためこれを必要としなかった。
|
| 次年度使用額の使用計画 |
論文の校閲および投稿料については、次年度の論文投稿に関わる費用として使用する。また、旅費および宿泊費の繰り越し分は物品費の繰り越し分と合わせ、次年度着手する新たな組織を対照とした実験にかかる物品費として使用する。
|
