２光子励起蛍光寿命画像法を用いた膜融合関連蛋白の構造と機能解析

2016 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 26460290
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 高橋 倫子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 講師 (60332178)
• 研究期間 (年度): 2014-04-01 – 2017-03-31
• キーワード: 神経 / シナプス / 伝達 / 開口放出 / 膜融合 / 蛋白質

研究実績の概要

SNAP25 のオリゴマー化がマウス神経細胞における超高速の伝達物質放出に重要であることを、2系統のSNAP25変異体を用いて証明した。実験ではSNAP25欠損マウスから単離培養した大脳皮質神経細胞を用いた。FRETプローブとして、ドナー色素をN末に結合させたmturquoise(mtq)-SNAP25 と、アクセプター色素を第二αヘリックスの直前に挿入したSN1-Venus(Ven)-SN2の二種を基本形とした。両者のFRETは、2光子励起蛍光寿命画像法を用い、軸索終末領域で計測した。通常は約15%の結合率を示し、免疫組織染色で、シナプス前終末分子：Basoonと共局在した。
第一にSNAP25のC末欠損体でプローブを作成した。7残基欠損体では結合率に変化は見られず、9残基欠損体では結合率が有意に減弱した。この際、20Hz 電気刺激を与えてシナプス伝達（IPSC）を計測すると、Δ9変異体では第一刺激による伝達が見られず、刺激を反復させると遅れた伝達が検出された。また、刺激後伝達までの潜時はΔ9で有意に延長した。以上より、SNAP25のC末はSNAP25の オリゴマー化（domain-swapping 構造形成）に必要で、速い伝達物質放出に関与することが示唆された。
第二に、SNAP25の二つのヘリックスを連結するリンカーの延長変異体を作成した。12残基～20残基延長体のいずれも、結合率は対照と同等だった。しかし、IPSCは、10残基以上の延長で有意な遅れが検出された。また、第一回刺激におけるIPSCの振幅も、10残基以上の延長で有意に減弱した。以上より、リンカーを延長させてもドメイン構造は構成されるが、適切なリンカー長が速い放出を起こすのに必須で、それは融合細孔を取り巻くSNARE複合体間（SNAP25リンカー領域）の張力に反映されると考察された。

研究成果

• [雑誌論文] Munc18b increases insulin granule fusion, restoring deficient insulin secretion in type-2 diabetes human and Goto-Kakizaki rat islets with improvement in glucose homeostasis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Qin T, Liang T, Zhu D, Kang Y, Xie L, Dolai S, Sugita S, Takahashi N, Ostenson CG, Banks K, Gaisano HY
  • 雑誌名: EBioMedicine 巻: 16 ページ: 262-274
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2017.01.030
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Design and synthesis of a new chromophore, 2-(4-nitrophenyl)benzofuran, for two-photon uncaging using near-IR light. (2016)
  • 著者名/発表者名: Komori N, Jakkampudi S, Motoishi R, Abe M, Kamada K, Furukawa K, Katan C, Sawada W, Takahashi N, Kasai H, Xue B, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Chem Commun (Camb) 巻: 52 ページ: 331-334
  • DOI: 10.1039/c5cc07664a.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Design and Synthesis of a 4-Nitrobromobenzene Derivative Bearing an Ethylene Glycol Tetraacetic Acid Unit for a New Generation of Caged Calcium Compounds with Two-Photon Absorption Properties in the Near-IR Region, and Their Application In Vivo. (2016)
  • 著者名/発表者名: Jakkampudi S, Abe M, Komori N, Takagi R, Furukawa K, Katan C, Sawada W, Takahashi N, Kasai H.
  • 雑誌名: ACS Omega 巻: 1 ページ: 193-201
  • DOI: 10.1021/acsomega.6b00119
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Opposing roles for SNAP23 in secretion in exocrine and endocrine pancreatic cells. (2016)
  • 著者名/発表者名: Kunii M, Ohara-Imaizumi M, Takahashi N, Kobayashi M, Kawakami R, Kondoh Y, Shimizu T, Shimizu S, Lin BZ, Nunomura K, Aoyagi K, Ohno M, Ohmuraya M, Sato T, Yoshimura S, Sato K, Harada R, Kim YJ, Osada H, Nemoto T, Kasai H, Kitamura T, Nagamatsu S and Harada A.
  • 雑誌名: J Cell Biol 巻: 214 ページ: 121-138
  • DOI: 10.1083/jcb.201604030
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] State-dependent diffusion of actin-depolymerizing factor/cofilin underlies the enlargement and shrinkage of dendritic spines. (2016)
  • 著者名/発表者名: Noguchi J, Hayama T, Watanabe S, Ucar H, Yagishita S, Takahashi N, Kasai H.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 6 ページ: ―
  • DOI: 10.1038/srep32897.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] Configuration of SNAP25 at the exocytic sites analyzed with 2-photon excitation FLIM (2017)
  • 著者名/発表者名: Takahashi N, Watanabe S, Sawada W, Kasai H.
  • 学会等名: 第94回日本生理学会大会
  • 発表場所: アクトシティ浜松（静岡県浜松市）
  • 年月日: 2017-03-29
• [学会発表] Two-photon fluorescence lifetime imaging of primed SNARE complexes. (2016)
  • 著者名/発表者名: Takahashi N, Sawada W, Noguchi J, Hasan U, Watanabe S, Kasai H.
  • 学会等名: 第39回日本神経科学学会大会
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • 年月日: 2016-07-22
  • 招待講演