| 研究課題/領域番号 |
26460291
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
藤井 拓人 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (50567980)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 癌 / 生理学 / 細胞・組織 / ナトリウムポンプ / イオンチャネル / 活性酸素種 |
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| 研究実績の概要 |
ナトリウムポンプ（Na,K-ATPase）の阻害剤である強心配糖体は、近年抗癌治療への有用性が示唆されている。申請者らは、癌細胞において、Na,K-ATPaseのイオン輸送を阻害しない低濃度（nMレベル）のウアバインが、細胞容積調節に寄与する容積感受性外向き整流性（VSOR）チャネルを活性化することで増殖抑制を引き起こすことを見出した。本研究では、癌細胞と非癌細胞の膜マイクロドメインにおけるVSORチャネル構成因子や調節因子の差異に着目した研究を行い、癌特異的なNa,K-ATPase/VSORクロストークの分子メカニズムおよびその抗癌メカニズムを明らかにすることを目指している。本年度は主に以下の成果を得た。
（１）ヒト癌細胞株において、NADPH oxidase（NOX）阻害剤によりウアバイン誘導性のVSORチャネル電流の活性化および増殖抑制効果が阻害されることを見出した。また、H2DCFDAを用いて細胞内活性酸素種（ROS）レベルを測定したところ、ウアバイン処理によりNOXによるROS産生が亢進することを見出した。興味深いことに、これらの現象は、正常（非癌）細胞においては観察されなかった。
（２）抗LRRC8A抗体を作製し、癌細胞の膜マイクロドメインにおけるVSORチャネルの構成分子LRRC8Aの分布を検討した。Na,K-ATPaseの場合と同様に、LRRC8Aの一部は膜マイクロドメインに分布していた。ヒト癌細胞株においてLRRC8AをsiRNAによりノックダウンしたところ、ウアバインによるVSORチャネル活性化および細胞増殖抑制は消失した。さらに、LRRC8Aノックダウン細胞では、Na,K-ATPaseのイオン輸送能が変化しないにも拘らず発現量は減少したことから、膜マイクロドメインにおいてLRRC8Aと非イオン輸送型（受容体型）Na,K-ATPaseが共役している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の研究によりNa,K-ATPaseとVSORチャネルとのクロストークにおいて、NOXにより産生されたROSが関連していることを見出した。また、作製した抗LRRC8A抗体およびsiRNAを用いた実験において、ウアバインにより、癌細胞の膜マイクロドメインに存在するLRRC8Aにより構成されるVSORチャネルが活性化することで癌細胞の増殖抑制が引き起こされることを明らかにした。この「Na,K-ATPase-NOX-VSOR(LRRC8A)シグナルソーム」は癌細胞の膜マイクロドメインにおいて特異的に存在しているものと考えられる。これら知見は、今後の癌細胞と非癌細胞の膜マイクロドメインにおけるVSORチャネル構成分子や調節分子の探索にむけた重要な手がかりとなる。また、癌細胞膜マイクロドメインにおけるLRRC8Aの機能解析を行う上で必要なLRRC8Aの全長クローニングも完了した。以上より、本研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、以下の研究を行い、癌細胞と非癌細胞の膜マイクロドメインにおけるVSORチャネル構成因子や調節因子の差異の解明、また癌特異的なNa,K-ATPase/VSORクロストーク関連分子を標的とする新たな癌制御法の基盤構築を目指す。
（１）癌細胞の膜マイクロドメインに存在するNOXのアイソフォームを特定する。同定したNOXアイソフォームとNa,K-ATPaseおよびLRRC8Aとの分子会合の可能性について検討する。さらに、それぞれの抗体を用いた免疫沈降法を行い、癌細胞膜マイクロドメインにおいてNa,K-ATPase/VSORクロストークに関与する分子を探索する。（２）癌細胞と非癌細胞の膜マイクロドメインにおけるLRRC8A以外のLRRC8アイソフォームの発現および機能について検討する。（３）非癌細胞に癌細胞特異的なVSORチャネル関連分子を発現させ、癌細胞において見られるウアバインによる効果が観察されるかを検討する。（４）低浸透圧刺激およびウアバイン処理において、関連分子の発現や局在変化について検討する。また、浸透圧変化によるVSORチャネル活性化とウアバインによる活性化に対して、関連分子のノックダウンおよび特異的阻害剤の効果を検討することで、VSORチャネルによる容積調節機能と癌制御機能を決定する機構を明らかにする。（５）同定した関連分子がチャネルのポア構造を持つと推定される場合、変異導入実験およびノックダウン実験を行い、VSORチャネルの機能発現に必須か否かについて検討する。（６）癌移植モデルマウスを用いて、移植癌細胞の増殖および転移に対する各種VSOR関連分子のノックダウンおよび阻害剤の効果を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は283円が余ったが、これは研究計画の変更や進行状況の変化等によるものではなく、283円以下の物品の購入を希望しなかったためである
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度において、物品請求費の一部として活用する予定である。
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