| 研究課題/領域番号 |
26460295
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| 研究機関 | 滋賀医科大学 |
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研究代表者 |
豊田 太 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (90324574)
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| 研究分担者 |
松浦 博 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60238962)
林 維光 滋賀医科大学, 医学部, 助教 (80242973)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| キーワード | 洞房結節細胞 |
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| 研究実績の概要 |
洞房結節細胞にみられる持続性内向きNa電流（Ist）の分子基盤を明らかにすることを目的に、イオン選択性が変化することが期待されるL型Caチャネル（Cav1.3）のバリアントの探索を行った。
まず、Istが洞房結節内の特定の細胞にしか観察されない点に着目し、単一細胞PCR法による検出を試みた。ストレプトアビジン磁気ビーズで修飾したプライマーを用いることで、比較的コピー数の少ないCav1.3転写産物の回収率をあげることができた。しかしながら、ポア領域を含むS5-S6領域における点変異は全く認められず、少なくともRNA編集のような転写後修飾は確認できなかった。
また、最近、カタツムリのCavチャネルがスプライスによりNa透過性が著しく増加する現象が報告された。そこで、ラットの洞房結節においてCav1.3のスプライスパターンを検討する実験を行った。Exon-Exon間にプライマーを設計し、通常のRT-PCR法でスプライスを調べたところ、Exon8-14、E30-34の領域において数多くのスプライスパターンが検出された。これらのスプライスフォームをIn-Fusion Cloning法でCav1.3発現ベクターに組み込み、パッチクランプ法を用いてイオン選択性を観察を行ったがNa透過性を示すものは確認できなかった。
一方、洞房結節細胞を用いたパッチクランプ実験を通して、Istの新たな性質を示す観察結果が得られた。それは、Istが細胞内Ca濃度により活性化されることである。この細胞内Ca感受性はIstの分子基盤を考える上で重要な手がかりとなる可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
L型Caチャネル（Cav1.3）の遺伝子産物の探索の結果、Istを再現しうるバリアントを同定するには至らなかったが、同時に遂行してきた電気生理実験からIstの分子基盤の解明につながる可能性のある新しい実験結果を得ることができた。この新たに浮上した仮説は、Cav1.3と機能的に連関した別のイオンチャネルの存在を示唆するものであり、現在検証を進めているところである。この新しい仮説の検証は、当初の計画には記載していなかったものではあるが、本プロジェクトの「Istの分子基盤を明らかにする」という最終目標に前進する可能性がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度を迎えた本プロジェクトは、Istの分子基盤の解明に向けて継続して実験を行う。特に、Istと細胞内Caとの関係を見出したことにより、細胞内Ca依存性の非選択型カチオンチャネル（NSCC）がIstを担う可能性について検証を行う予定である。具体的には以下の点に焦点をしぼり実験を遂行する。
１）NSCCの種々の遮断薬がIstに及ぼす効果をパッチクランプ法で検証する。
２）マウス洞房結節におけるL型Caチャネル（Cav1.3）と細胞内Caとの関係をCa蛍光法により明らかにする。
さらに、これらの実験を通して、Istを介在する可能性のあるNSCC分子が同定された場合、遺伝子改変マウスを用いた検討など、さらに深いレベルでの検証を模索していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の計画よりも、より魅力的な仮説が浮上したため、研究の方向性が大きく変化した。そのため、実験計画の見直しが必要となり、必要な経費に少なからず変更があった。特に遺伝子産物のスクリーニングにかかる経費が削減されたが、一方で電気生理学実験にかかる経費が今後増加することが予想されるため、次年度使用分として確保した。
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度に繰り越した予算は、電気生理実験や共焦点顕微鏡を用いたCa蛍光測光法で必要となる動物ならびに薬剤やガラス器具などの物品費用にあてる予定である。
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