| 研究課題/領域番号 |
26460319
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| 研究機関 | 高知大学 |
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研究代表者 |
谷口 睦男 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 准教授 (10304677)
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| 研究期間 (年度) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| キーワード | 電気生理学 / 鋤鼻系 / シグナル伝達 / 相反性シナプス |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、前年度で明らかにしたバゾプレシンのV1a受容体を介するIPSC抑制作用の作用点の同定をさらに進めた。
前年度までの結果は、僧帽細胞を刺激して生じるIPSCに対するバゾプレシン受容体の作動薬および阻害薬の効果を調べたものであり、僧帽細胞から顆粒細胞へのグルタミン酸作動性シナプス伝達と、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達の両方が含まれている。より正確な知見を得るためには、片方ずつ分離して調べる必要があった。
そこで先ず、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達における、バゾプレシンの作用を調べた。CNQXおよびAP5を用いて僧帽細胞から顆粒細胞へのグルタミン酸作動性シナプス伝達を遮断しておき、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達がバゾプレシンによって影響を受けるかを調べた。
顆粒細胞にパッチ電極を適用し、TTX存在下において、顆粒細胞膜の自発性興奮により生じるGABA作動性IPSCを膜電位固定下で記録した。バゾプレシンの細胞外投与によりmIPSCの発生頻度、大きさとも減少する細胞、どちらか一方だけ減少する細胞など、バゾプレシンの作用点は細胞ごとに異なること（作用点が僧帽細胞側にあるシナプス、顆粒細胞側にあるシナプス、両方にあるシナプス）が明らかになった。
このように、バゾプレシンの作用点は細胞ごとに異なることが示唆されたため、個々の細胞からの応答に加えて、より多くの細胞からの応答を記録できる集合電位記録も行った。顆粒細胞に由来する集合電位応答にはバゾプレシンは影響しないことが明らかになった。この結果は、個々の細胞における作用点が異なる（バゾプレシンの影響が現れる細胞と現れない細胞の両方が存在する）ため、集合電位記録ではバゾプレシンの作用が平均化されたためと考えられ、上述の個々の細胞における結果を支持した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
該年度は、バゾプレシンの、細胞レベルでの作用（具体的には相反性シナプス電流に対する作用）をさらに明らかにすることを継続目標とした。上記相反性シナプス電流に対する抑制作用に関わっているバゾプレシンの作用点について、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達に関する新たな知見が得られた。この知見は、パッチクランプ法と集合電位記録法の2種類の異なる記録方法から得られた成果である。フェロモン記憶に必須である上記相反性シナプス伝達の特性に関する従来の知見を着実に発展させるものであり、当該研究は順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) 相反性シナプス電流に対するバゾプレッシン受容体の作用
当該年度は、相反性シナプス電流に対する抑制作用を有するバゾプレッシンの作用点のうち、顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達について調べた。細胞ごとのばらつきが大きいため、来年度はさらに例数を増やして確実な結果が得られるように解析を継続する。
一方で、バゾプレッシンの作用点が、上述のGABA作動性シナプス伝達上ではなく、僧帽細胞から顆粒細胞へのグルタミン酸作動性シナプス伝達上にある可能性も考えられる。そこで、Picrotoxinを用いて顆粒細胞から僧帽細胞へのGABA作動性シナプス伝達を遮断しておき、僧帽細胞から顆粒細胞へのグルタミン酸作動性シナプス伝達がバゾプレシン によって影響を受けるのかどうかを調べる。
(2) シナプス伝達の可塑的変化の測定-----上記相反性シナプス電流の大きさを記憶形成群と未形成群とで記録し、比較する。また、(1)と同様の実験を記憶形成群で行い、記憶形成群と非形成群とで各種阻害薬および作動薬の効果に差がないか調べる。これにより、記憶形成の有無によって生じる神経回路の差異を調べ、フェロモン記憶の機構を神経回路変化という観点から明らかにする。フェロモン記憶により可塑性が誘導されるシナプスが少ない場合は、記憶に起因する相反性シナプス電流の変化を効率的に捉えるため、次の方法により対処する。
・LTP誘導に伴う相反性シナプス電流変化の測定-----当研究室では僧帽細胞の軸索束（外側嗅索LOT）を逆行性に刺激すると、僧帽細胞から顆粒細胞へのシナプス伝達に長期増強（LTP）が誘導されることを、スライス標本からの集合電位記録により見出している。LTPを誘導したスライス標本を用い、相反性シナプス電流に及ぼすバゾプレシン作動薬および阻害薬の影響を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究の申請時点では、本研究の研究対象である相反性シナプスのシナプス伝達に影響を及ぼす機能分子を探究するために、様々な機能分子候補それぞれに対する阻害薬および作動薬の購入を計画した。初めに試みた機能分子候補の作動薬や阻害薬が、シナプス伝達に作用するとは限らず、むしろ何種類も試してようやく有効な機能分子候補にたどりつく可能性は十分あり得ることだからである。
研究代表者の慎重な機能分子候補の絞り込みが効を奏し、初めに試したバゾプレシンが相反性シナプス伝達に作用することを見いだし、研究を進めることができた。その他の機能分子候補に関連した試薬の追加購入を減らせたことが、経費の節約に役立った。また、測定・解析機器類の一定頻度で生じる故障に備えた修理代・維持費を計上していたが、使用時に細心の注意を払って使用した為、今年度はその必要が殆どなく経費の節約につながった。以上の理由から次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
・設備備品費として5万円を計上。電気生理測定・解析機器の修理代、維持費に用いる。・薬品は、20万円を計上。各種グルタミン酸受容体阻害薬および作動薬、バソプレッシン受容体阻害薬および作動薬、この他の主なものは電位依存性Naチャネル阻害薬や、細胞内液作成時に使用するMg-GTPなどを購入する。実験動物は、9.0万円を計上。年間に120匹を使用するとして算出した。購入費（自家繁殖を併用して費用の軽減を計るが飼育スペースに限りがあるため半数程度は新規に購入する必要がある）および飼育代（値上がり分を含む）として妥当かつ必要な額を使用する。実験器具は、4.0万円を計上。ガラス器具（メジューム瓶やメスシリンダ等）、スライス作成時の刃やメスの替え刃の購入に充てる。論文別刷りは5万円を計上した。
・旅費等は15万円を計上した。次年度に開催される日本神経科学会および日本生理学会での研究成果発表に使用する。
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